一种提高植物耐铝能力的载体及构建方法

专利名称：一种提高植物耐铝能力的载体及构建方法
技术领域：
本发明具体涉及一种在植物体内构建新的柠檬酸合成途径以提高植物耐铝能力的载体及构建方法，属于植物基因工程领域。
背景技术：
铝是地表上第三大元素，对植物的毒性很强。当土壤溶液酸化后PH值下降到一定值时，铝离子就会从硅酸盐或氧化物中释放出来，溶解到土壤溶液中(Ma JF, Furukawa J. 2003. Recent progress in the research of external Al detoxification in higher plants: a minireview. J Inorg Biochem. 97:46-51)。可溶性的铝可以分为以下几类自由铝或是Al (H2O)63+、聚合铝々113及低分子量铝化合物。随着土壤pH值的上升，Al (H2O)63+转变为A1(0H)2+、A1(0H)2+。在中性土壤中，主要以难溶的Al (OH)3形式存在。在碱性条件下主要是以铝酸盐阴离子Al (OH)4—形式存在(Matsumoto H. 2000. Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants. Int Rev Cytol. 200:1-46)。不同形态的铝对植物的毒性有明显的差异。目前一般认为在PH值低于4. 5的酸性土壤中，铝主要是以 Al (H2O)63+形态存在的，即通常所说的Al3+，这一形态的铝被认为是对植物毒性最强的形态。铝并不是植物矿质营养中的必需元素，铝毒被认为是酸性土壤上影响作物生长的主要的限制因子。微摩尔水平的铝离子即可对植物产生毒害，而酸性土壤溶液中Al3+的浓度约为 10-100 μ mol/L (Ma JF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants. Plant Cell Physiol. 41:383-390)。铝对根的毒害作用部位是根尖，包括根冠与根分生区，因此植物发生铝毒害的最主要症状是其根生长受到快速受阻，这可能是铝通过一种未知的信号传导途径间接抑制根的生长。此外，铝离子交换量占土壤中阳离子交换总量的20% 80%，容易导致土壤阳离子流失，如造成磷、钾、钙、镁、硼、 钼等营养元素的缺乏。铝也可以和磷酸基、羟基等极性基团结合，因此它可以与细胞质及膜蛋白结合，影响膜的结构和功能。同时铝可以和ATP形成Al-ATP复合物，使植物细胞能量代谢过程受到限制。全世界有39. 5亿hm2酸性土壤，其中可耕地土壤面积为1. 79亿hm2，主要分布在热带、亚热带及温带地区，尤其是发展中国家(Kochian LV. 1995. Celluar .Mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plant. Annu Rew Plant physiol plant mol Biol. 46:137)。我国酸性土壤遍及南方15个省区，总面积为2030万hm2，约占全国土地总面积的21%。一直以来，人们通常靠大量的施用石灰，来提高土壤的pH值，使游离铝沉淀，解除铝毒害。但是这种方法难以彻底解决土壤酸度问题，它只能对表层土壤进行改良，对深层土壤的酸性没有多大的作用，同时还存在着潜在的环境问题。因此，筛选和培育耐铝作物品种是提高酸性土壤上的作物产量有效且可持续的方法。许多实验表明，植物可以通过分泌螯合剂如有机酸或磷酸将离子态的铝变成螯合态的铝从而解除铝毒害。Miyasaka等人首先发现，在铝胁迫条件下，耐铝的菜豆品种向根际环境分泌的柠檬酸比敏感品种高10倍(Miyasaka SC, Buta JG, Howell RK, Foy CD.
31991. Mechanisms of aluminum tolerance in snapbeans: root exudation of citric acid. Plant Physiol. 96(3) : 737-743)。Pellet等发现在铝胁迫条件下耐铝玉米品种分泌的柠檬酸比敏感品种高7倍(Pellet DM, Grunes DL, Kochian LV. 1995. Organic acid exudation as an aluminum-tolerance mechanism in maize {Zea mays L. ). Planta. 196(4) : 788-795)。Delhaize等从单一的主基因座(Altl)水平上对铝有不同耐受能力的一对近似同源的小麦品系进行研究，发现铝敏感品系根尖积累的铝为耐性品系的3-8倍， 而耐性品系苹果酸的分泌比敏感性品系高出10倍左右，这些结果说明小麦通过苹果酸螯合铝离子，减少铝离子的毒害保护根尖(Delhaize E, Craig S, Beaton CD, Bennet RJ, Jagadish VC, Randallet PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.) : I. Uptake and distribution of aluminum in root apices. Plant Physiol. 103(3): 685 - 93； Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ. 1993 Aluminum tolerance in wheat {Triticum aestivum L.): II. Aluminum-stimulated excretion of malic acid from root apices. Plant Physiol. 103(3) : 695 - 702)。此后，研究者对铝诱导的有机酸分泌和植物耐铝能力作了大量深入的研究和探索。有机酸的分泌也被认为是植物耐铝的重要机制之一。目前已证实铝胁迫下根系分泌苹果酸、草酸和柠檬酸。这3种有机酸都可以和铝螯合，但他们对铝离子的螯合能力并不相同，螯合能力由大到小依次为柠檬酸、草酸、苹果酸。有机酸解除铝毒的能力主要与它们的化学结构有关，即-OH、-C00H官能团在主 C 链上的位置(Hue NV, Craddock GR, Adams F. 1986. Effect of organic acids on aluminum toxicty in subsoils. Soil Sci Am J. 50:28-34)。植物体内柠檬酸的合成主要通过柠檬酸循环中柠檬酸合酶(CS)的作用完成，CS 催化来自糖酵解或其它异化反应的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合合成柠檬酸。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4植物CO2固定的一个重要酶，也是有机酸代谢中的一个关键酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HC03_生成草酰乙酸(OAA)和无机磷酸(Pi)的不可逆反应。 很多研究结果证明通过在植物中过量表达^增加植物中CS的酶活性，可以提高转基因植物对铝的耐受性，这也说明在植物中过量表达α是一种提高植物耐铝能力的有效手段。过量表达玉米C4型全长的转基因水稻叶片中PEPC的活性显著增加，从而导致叶中和根中有机酸含量的增加，耐铝能力显著增强(Begum HH, Osaki Μ, Watanabe Τ, Shinano Τ. 2009. Mechanisms of aluminum tolerance in phosphoenolpyruvate carboxylase transgenic rice. J Plant Nutr. 2(1) : 84-96)。这些研究结果说明PEPC的过量表达也能提高植物抗铝毒能力。在大豆和菜豆的耐铝型栽培种中已经发现CS和PEPC的活性在铝胁迫下增加，这有助于有机酸的合成和分泌，增强植物的耐铝能力。切除茎的植物及在黑暗条件下生长的植物有机酸的分泌量显著减少，这说明光合作用和植物在铝胁迫下有机酸的分泌活动 W^ffi^ (Range 1 AF, Rao IM, Braun H-P, Horst WJ. 2010. Aluminium resistance in common bean {Phaseolus vulgaris) involves induction and maintenance of citrate exudation from root apices. Physiol Plant. 138(2): 176-190; Yang ZM, Nian H, Sivaguru M, Tanakamaru S, Matsumoto H. 2001. Characterization of aluminium-induced citrate secretion in aluminium-tolerant soybean {Glycine max) plants. Physiol Plant. 113(1) : 64-71)。1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50%。控制rbcS 基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在叶片中的表达最强，常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达。现有的一些研究通过在在转基因植物中过量表达有机酸代谢相关酶的基因都能增加有机酸的分泌，从而提高植物耐铝能力。但这些研究都是在植物中过量表达一种基因， 目前还没有在植物中过量表达两个或以上基因大幅提高植物耐铝能力的报道。此外，现有的研究都利用组成型启动子在转基因植物中过量表达有机酸代谢相关基因，有些转基因植物在正常条件下生长时个体比对照植物小，这种现象被认为可能是由于有机酸不断分泌到植物体外而消耗大量碳源引起的。

发明内容
本发明的目的在于提供一种在植物体构建新的柠檬酸以提高植物耐铝能力的方法利用PrbcS启动子在烟草叶片细胞质中同时表达cs和ρ印c，通过PEPC的作用利用糖酵解产生的PEP生成更多的草酰乙酸，而草酰乙酸含量的增加使CS有更多的底物合成柠檬酸，这样可在细胞质中构建一条柠檬酸合成途径，以期增加柠檬酸的合成，从而进一步提高植物对铝的抗性。同时提供过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体，该载体是含有嗜热蓝藻(Synechococcus vulcanus)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(即PEPC基因)的植物表达载体。为了实现本发明的上述目的，本发明通过下列技术方案实现
本发明所提供的用于提高植物耐铝毒能力的载体，是具有光诱导启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因来源于嗜热蓝藻(Synechococcus vulcanus)0 所述的来源于嗜热蓝藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC (登录号为AB057454)的一个突变体(889位的Lys被突变成了 Ser)，该突变体PEPC对苹果酸的反馈抑制不敏感。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。所述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7 (购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本发明的上述植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC由下述方法构建而成
(1)从GenBank中查找嗜热蓝藻PEPC的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘
ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘ 5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位点；3’端引物ρ印c3， 末端加损ol酶切位点；以本申请人构建的一个入门质粒载体pENTR 2B-KsPEPC (Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)为模板扩增得到PEPC突变体的全长编码区的DNA片段；
(2)回收并纯化PEPC全长基因片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-PEPC ；
(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP (pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法见申请号为200710066422. 9的申请)和pUCm-PEPC，回
5收载体pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；
(4)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC，通过Gateway技术的LR反应把 PrbcS-PEPC亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway的目的载体)中，获得PEPC基因的植物表达载体 pH2-35S-PrbcS-PEPC。本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建PEPC基因的植物表达载体，同时在植物中转化PPZP211-PrbcS-cs植物表达载体(pPZP211-PrbcS-cs的构建方法见申请号为 200710066419. 7的申请)，以便在转基因植物叶片的细胞质中同时过量表达PEPC基因和CS 基因，在植物细胞之中构建新的柠檬酸合成途径。直接利用光合作用产物通过糖酵解途径产生的碳骨架合成柠檬酸，使之分泌到细胞外，最后通过根系进入到土壤中，螯合土壤中的铝离子，解除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害，提高转基因植物耐铝毒的能力。将植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC通过农杆菌介导或其它物理、化学方法导入植物组织并整合到植物基因组中，再将植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs导入含有PEPC 基因的植物组织并整合到转基因植物基因组中，得到含PEPC和CS的转基因植物。本发明的专用载体旨在用于提高植物对铝毒的耐受能力，对单子叶和双子叶植物都适用，如烟草、 水稻、大豆、小麦等。本发明转PEPC和CS基因的烟草植株柠檬酸合成酶活性是野生型烟草的2. 4 2. 6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型烟草的2. 2 2. 4倍。用13C NMR分析 NaH13CO3在转基因植物中的代谢谱，结果显示在铝胁迫条件下，同时转和G基因烟草中来自NaH13CO3的13C代谢流进入葡萄糖或果糖后通过糖酵解途径进入有机酸如0AA(PEPC 反应的产物)和柠檬酸(CS反应的产物)及苹果酸的流量都高于野生型烟草和单转CS的烟草，说明在转基因烟草中基因和^基因的过量表达成功地构建了一条新的柠檬酸合成途径，使转基因烟草中柠檬酸的合成量显著增加。在受到铝胁迫时，转和^基因的烟草柠檬酸的分泌量是野生型的3. 8 4倍，根系生长良好，能提高植物对铝毒的抗性。本发明的专用载体能在提高植物(如烟草)对铝毒的耐受性方面发挥很大作用，特别是在中国南方酸性红壤中，可显著促进植物对铝毒的耐受能力，因而也为植物品种改良提供了一条新途径。


图1为在转基因植物细胞质中构建新的柠檬酸合成途径策略； 图2为中间载体的构建策略；
图3为中间载体的检测
A 重组质粒的 PCR 检测1 :DNA Marker III ；2_3 以 pUCmjiffl/7 为模板，用
引物pepc5和pepc3扩增到的PCR产物；
B -.Hind IlWEcoR I 分别酶切检验 pUCm-/ ^1。1 =PUCiiitcEdC 重组质粒；2-3 -.Hind III 酶切 pUCm-Z^/T 重组质粒；4_5 -.EcoR I 酶切 pUCm-Z^/T 重组质粒；6 :DNA Marker III ；
C -.Nco I 和损ο I 双酶切检验 pUCm-/^/^。1 :DNA Marker III ；2 -.Nco I 和损ο I 双酶切PUCmTcE^重组质粒；3重组质粒。图4为入门克隆载体pENTR*-PrbcS_/忍/C的构建策略；图5为入门克隆载体pENTR*-PrbcS-/ T的检测
A 重组质粒 pENTR^-PrbcS-Z^/T的 PCR检测；1_5 以 pENTR^-PrbcS-/^/^质粒为模板， 利用ρ印c5和ρ印c3引物扩增得到的PCR产物；6 =DNA Marker III ；
B 用 BatnHl 和 Sma\ 双酶切检验 pENTI^-PrbcS-/^/^ ;1 :DNA Marker III ；2-5 -.BamHl 和 Smal 双酶切 pENTt^-PrbcS-Z^/T重组质粒；6 :pENTR*-PrbcS-Z^CMi ； 图6为用Gateway的LR反应构建/^/C基因的植物表达载体策略； 图7为PEPC植物表达载体pH2-35S-PrbcS-/^/T的检测和农杆菌菌落的PCR检测 A M BamHl 和 Smal 双酶切检验 pffi-SSS-PrbcS-/^/^ ； 1_2 M BamHl 和 SmaY 双酶切 Pffi-SSS-PrbcSTcST 质粒；3 :DNA Marker III ；
B 转化 Pffi-SSS-PrbcSTcST 质粒的农杆菌 PCR 检测；1 :DNA Marker III ；2 以 pH2-35S-PrbcS-/忍/C质粒为模板，利用ρ印c5和ρ印c3引物扩增得到的PCR产物；3 以 PH2GW7质粒为模板，利用pepc5和ρ印c3引物扩增得到的PCR产物；4 以农杆菌菌落为模版，利用P印c5和ρ印c3引物扩增得到的PCR产物；
图8为PEPC和CS在转基因烟草中的插入情况以及转录水平检测 A Southern blot检测转基因烟草中α基因插入情况；以CS基因的寡居核苷酸片断为探针作Southern blot分析；pcsl, pcs4, pcsl4 -难PEPC^cs的双转基因烟草；rcsl, rcs4, rcsl4 只转α的单转基因烟草；WT 未转基因的野生型烟草(负对照)；
B =Southern blot检测转基因烟草中/^/T基因插入情况；以PEPC基因的寡居核苷酸片断为探针，作Southern blot分析；ρ印c2，pepcl4, ρ印cl7 只转基因的单转基因烟草，其他株系的名称与A中的描述相同；
C =RT-PCR检测烟草中CS基因的转录水平；Marker =DNA Marker III ；cs 正对照(以质粒pPZP211-PrbcS-cs为模板扩增得到的PCR产物；
D :RT-PCR检测烟草中PEPC基因转录水平；Marker =DNA Marker III ；pepc 正对照(以质粒pH2-35S-PrbcS-/忍/C为模板扩增得到的PCR产物； 图9为PEPC和CS在转基因烟草中的酶活性测定 A =CS在转基因烟草中的酶活性测定； B =PEPC在转基因烟草中的酶活性测定；
图10为IO13C-NMR分析50 μ mol · L-1铝胁迫24h后转基因烟草中NaH13C03代谢谱； 图11为13C-NMR分析没有铝胁迫时转基因烟草中NaH13C03代谢谱； 图12为转基因烟草柠檬酸分泌量的测定 A 转基因烟草在无铝胁迫条件下柠檬酸的分泌量； B 转基因烟草在30 μ mol/L的AlCl3胁迫下柠檬酸的分泌量； 图13为PEPC和CS双转基因烟草在铝毒胁迫下根相对生长率的测定； 图14为转基因烟草在有铝毒胁迫的沙质土壤中地上部分的生长情况及株高；A和B转基因烟草在有铝胁迫的沙质土壤中的生长状况C转基因烟草在有铝胁迫的沙质土壤中生长时的株高；
图15为转基因烟草在有铝胁迫的沙质土壤中根部的生长情况及根干重； A 转基因烟草在有铝胁迫的沙质土壤中根的生长情况； B 转基因烟草在有铝胁迫的沙质土壤中根的干重。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1 基因扩增及TA克隆
/WT基因DNA编码区的扩增及TA克隆策略如图2所示，首先根据PEPC基因序列设计一对引物，序列如下
ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘
5，端引物ρ印c5末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位点；3，端引物ρ印c3 末端加损ο I酶切位点。以构建的一个含有嗜热蓝藻突变体基因的入门载体pENTR 2B-KsPEPC(Chen LM. Genetic Engineering of photosynthesis in C3 plant. Yunnan: Yunnan Science and Technology press, 2008)为模板，用PEPC特异引物ρ印c5和ρ印c3扩增得到突变体 Λ57Τ全长基因的编码区DNA片段(3. 0Kb)，回收并纯化PEPC全长基因片段，并将其连接到 PUCm-T载体上，转化大肠杆菌感受态DH5 α，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。以重组质粒为模板，用引物P印c5和ρ印c3引物扩增得到3. Okb的PCR产物(图3A)。根据/^/T片段上的酶切位点，用BernHl和Sma\双酶切重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的PEPC插入片段(图2B)。根据阳性重组质粒pUCm-PEPC载体两端的多克隆位点，用AfcoI和损ol双酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pUCm-PEPC含有3. Okb左右的DNA插入片段(图 3C)。实施例2 入门克隆载体pENTR*-PrbcS_PEPC的构建策略
Λ57Τ基因入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC的构建策略如图4所示，首先用NcoI和XhoI 切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-PEPC，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片断 pENTR*-PrbcS (4. Okb)及 pUCm-PEPC 被切割产生的 PEPC 基因的 DNA 片断(3. Okb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*_PrbcS和/^/C基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞 DH5 α，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50 mg/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体 pENTR*-PrbcS-PEPC，用/^/C上下游的特异性引物ρ印c5和ρ印c3进行PCR扩增，所选的质粒都能扩增出一条3. Okb的PEPC条带(图5A)。用NcoI和XhoI双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上有3. O kb的/^/C基因片段(图5B)。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-PEPC。实施例3 =PEPC基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS_PEPC的构建策略
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-PEPC亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway 的目的载体)中(图6)。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pH2GW7， 在 Gateway 的 LR反应体系中加 pENTR*-PrbcS-PEPC和 pH2GW7 各 150 ng, 1 μ 1 LR ClonaseII Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25°C反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-PEPC整合到pH2GW7中获得PEPC的植物表达载体质粒pH2-35S-PrbcS-PEPC (图6)。用反应混合物转化高效率(IO8)的大肠杆菌感受态细胞DH5 α，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素 (Spe,50 mg/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和理论预测值相符的整合质粒pH2-35S-PrbcS-PEPC进行检测， 用基因内部的酶切位点用BamHl和SmaY双酶切重组质粒pH2-35S-PrbcS_PEPC，可以得到2. 5 kb的片段(图7A)。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。PH2GW7携带的筛选标记基因为潮霉素抗性基因 (Hgr)，这样可用加有潮霉素的平板筛选转基因植物。实施例4 用基因的植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体 pH2-35S-PrbcS-PEPC转入农杆菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混勻；将混合物加入到预冷的电转化杯中， 轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1 mm的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入 0.5ml SOC培养基，混勻，转移到1.5 ml的离心管中；28°C,200 rpm摇床培养3_5h ；室温下， 7500 rpm离心1 min，弃大部分上清，保留100 μ 1将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50 mg/ml)的LB固体培养基上，28°C培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20 μ 1 ddH20中，98°C处理5分钟后取出5 μ 1农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用/^化基因的上下游的特异性引物P印c5和ρ印c3进行PCR扩增，所选的菌落能扩增出一条3. 0 kb的条带(图7B)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。实施例5 用含有基因植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有质粒pH2-35S-PrbcS-PEPC的农杆菌单菌落接种于50 ml的LB培养基中(含 Spe, 100 mg/ml)，180rpm，28。C 培养 24 h，待菌液 OD6tltl 至 1. 0 左右，离心 10 min(3000rpm), 沉淀菌体。再用10 ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10 min (3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD6tltl值为0. 5。 制备烟草OVicoiiaaa tabacum cv. Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MSl (MS+NAA 0.21 mg/ml+BAP 0. 02 mg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含潮霉素(25 mg/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NAA 0.53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml) 上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含潮霉素(25 mg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。实施例6 含有α基因植物表达载体的农杆菌转化含有/^/C的转基因烟草
挑取携带有质粒pPZP211-PrbcS-CS的农杆菌单菌落(见本申请人的另一项专利申请， 申请号为200710066419. 7)接种于50 ml的LB培养基中(含Spe，100 mg/ml)，摇菌及悬浮方法同实施例5。制备Λ57Τ转基因烟草的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化已插入 /WT基因的烟草，愈伤组织的培养同实施例5，将外植体转移至含潮霉素(25 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NAA 0. 53 mg/ml+BAP 0.5 mg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含潮霉素05 mg/ml)和卡那霉素(50 mg/ ml)的MS培养基上进行根的诱导。实施例7 M和/ 1基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测 为了确认通过潮霉素和卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的
DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片100 mg左右置于1.5 ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入 900 “1预热到65。(的2\07^缓冲液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB观)，65°C度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500 μ 1氯仿一异戊醇混合液(24 :1)摇勻，离心10 min (7500 rpm)后转移上清至1.5 ml EP管；再次加入500 μ 1 氯仿一异戊醇混合液(24 :1)摇勻，离心10 min (7500 rpm);取出上清置于新的EP管中，加 Λ 1/10体积3Μ ρΗ5· 2醋酸钠和等体积异丙醇，摇勻后4°C离心20 min( 12000 rpm);弃上清，用75%乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组 DNA样品。用Kpn I消化20 mg基因组DNA，用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳分离消化后的DNA， 用0.4 mol L—1 NaOH作Southern印迹，通过毛细管作用把酶切的基因组DNA转移到尼龙膜 (Hybond-N+ membrane)上。检测α基因的Southern杂交用生物素标记的含有α基因编码区特异的寡核酸探针 5 ‘ -Biotin-AGACCAGAAGAGGTTTGGACTTGAAGCCACCGCACAG AGT-3 ‘ 作杂交试验。检测/ 1基因的Southern杂交用生物素标记的含有/ 1基因编码区特异的寡核酸探针为 5' -Biotin- GAGGATCTCAAGCACGCCCCAGCGGTGCTGACCCAACTATT-3 ‘。在 37。C 预杂交液中预杂交6 h后，加入适量探针进行过夜杂交。杂交结束后，用洗膜液(2X SSC和 0. 1% SDS)于37°C洗膜2次，每次15 min。然后用5%的脱脂牛奶封闭1 h，再加入偶联有辣根过氧化物酶的生物素抗体(Invitrogen)孵育1 h。用化学发光底物试剂盒(SuperSignal Western Blotting Kits，Pierce)检测杂交信号。对cs的Southern杂交结果如图8A所示，3 个 C1S 和双转基因烟草株系(pcsl, pcs4, pcsl4)和 3 个 pPZP211-PrbcS-cs 转基因株系(rcsl，rcs4, rcsl4)都有2条以上的杂交带，而野生型(WT)只有一条杂交带，这说明所转的^基因cDNA已成功插入转基因烟草的基因组中。对PEPC的Southern杂交结果如图8B所示，pcsl、pcs4和pcsl4双转基因株系和3个pH2-35S-PrbcS-pepc转基因株系(P印c2，pepcl4, ρ印cl7)都有杂交带，而野生型则没有，这说明所转的/ 1基因已成功插入转基因烟草的基因组中。为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA， 反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测G和/ ’/C基因在转基因植物中的转录水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA，取植物嫩叶约 0. 1 g，加入 1 ml 的 TRIzoL 提取液在研钵中研磨，室温静置5 min后移入离心管，再加入0. 2 ml氯仿，振荡混勻，离心15 min (12000 rpm)，转移上清液至新管，加入0.5 ml异丙醇，混勻室温放置10 min，4°C离心10 min( 12000 rpm)，弃上清，沉淀用75%乙醇1 ml清洗，4°C离心5 min(7500 rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约 0.1 μ g-5 μ g,oligo (dT) 50 ng, 10 mM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC处理水补足至 10 μ ，混勻后，短暂离心将之收集于管底，置于65°C加热5 min，冰浴10 min，加入反应混合物9 μ (5Xreaction buffer 4 μ 1,25 mM MgCl2 4 μ 1,0. IM DTT 2 μ 1，RNA酶抑制剂 1 μ 1)，将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，25°C保温2 min，加入1 μ M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，25°C保温20 min,然后42°C 保温70 min，合成cDNA。以cDNA为模板，检测cs用编码区的两个上下游引物cs5 (5'-ATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3 ‘)和 cs3(5' -TCATGCTTTCTTGCAATGGTTC-3 ‘)，检测 ρ印c 用位于编码区内的两个上下游引物P印cp5 (5' -ATTAGCTCACGGCCAACACG-3‘)和ρ印cp3 (5' -TTAGCCTGTATTGCGCAT CCC-3‘)。用烟草 18s rRNA 作为内参，扩增 18s rRNA cDNA所用上下游引物为 18S5(5' -GGGCATTCGTATTTCATAGTCAG-3‘)和 18S3(5' -AAGGGATACCTCC GCATAGC-3')。对α的RT-PCR分析结果如图8C所示，pcsl、pcs4、pcsl4双转基因株系和 rcsl、rcs4、rcsl4转基因株系α基因的转录水平均明显高于野生型。%ρ印c的RT-PCR 分析结果如图8D所示，pcsl、pcs4、pcsl4双转基因株系和ρ印c2、ρ印cl4、ρ印cl7转基因株系可扩增出与正对照相同的目的条带，而以野生型烟草则没有明显的目的基因条带。这些结果说明转入的^和/^/C基因在转基因植物中有较高的转录水平。实施例8 转基因烟草中CS和PEPC的活性分析
选取经RT-PCR分析表明有目的基因的转录物的转基因烟草植株测定柠檬酸合成酶的活性。从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取0.2 g烟草叶片，加1 ml蛋白抽提液[100 mM Tris-HCl (pH 7.5) ； 10% (V/V)甘油；10 mM 巯基乙醇；1 mM PMSF ；5%(ff/V) PVP]研磨，转移至EP管中，13000 r/min离心25 min (4°C)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。柠檬酸合成酶的活性测定按Anoop等(Anoop VM, Basu U, Mccammon MT, McAlister-Henn L, Taylor GJ. 2003. Modulation of citrate metabolism alters aluminium tolerance in yeast and transgenic canola overexpressing a mitochondrial citrate synthase. Plant Physiol, 132(4) : 2205—2217)的方法进fiS 原理为L-苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成草酰乙酸，而草酰乙酸极不稳定，在柠檬酸合成酶和乙酰辅酶A的作用下，能够生成柠檬酸。在该反应中，通过测定波长为340 nm处 NADH的增加量从而获得CS的相对酶活性。测定CS酶活性的反应体系为0.05 M Tris-HCl (pH 7. 5)，10 mM L-Malate, 10 U MDH, 0. 5 mM NAD，在 Iml 的反应体系中加入 100 μ g 烟草蛋白样品。在紫外分光光度仪上测其340 nm处的吸收值(0D值)，待读数稳定后，加入 10 μ L 4 mM CoA (乙酰辅酶A)，在Imin之内检测340 nm处的吸收值。计算两次读数的差值，得到CS酶活性数据。其中rcsl、rcs4和rcsl4转基因株系的CS酶活性是野生型的 2-2. 4倍，pcsUpcs4和pcsl4双转基因烟草的CS酶活性是野生型的2. 4-2. 6倍(图9A)。PEPC酶活测定参照Ku等(Ku MSB, Agarie S, Nomura Μ, Fukayama H, Tsuchida H, Ono K, Hirose S, Toki S, Miyao Μ, Matsuoka Μ. 1999. High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nature Biotechnology, 17(1) : 76-80)的方法进行。反应体系为 50 mM Tris-HCl ( pH 8· O )， IOmM MgSO4,10 mM KHCO3, 5 mM 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，0. ImM NADH，苹果酸脱氢酶(MDH， 约IOU )，反应液总体积1 ml，30°C水浴预温10 min，以加入酶粗提物来启动反应，迅速检测 340 nm下每隔60 s吸光度的下降速率。结果显示ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7转基因株系的 PEPC酶活性是野生型的2. 1-2. 3倍，pcsl、pcs4和pcsl4双转基因烟草的PEPC酶活性是野生型的2. 2-2. 4倍(图9B)。这也说明pcsl、pcs4和pcsl4双转基因烟草叶中CS和PEPC
11的酶活性都增强。实施例9 =NaH13CO3标记试验和13C-NMR分析
为了确定在烟草叶片中过量表达的M和/确实能利用光合作用合成的糖通过糖酵解产生的PEP增加柠檬酸的合成，首先将烟草植株浸入150 mL的NaH13CO3处理液(5 mmol Γ1 NaH13CO3,0. 1% MES (w/v, pH 5. 7))中，在 25° C 条件下持续光照(100 Mmol πΓ2 s — 1) 并振荡培养(100 rpm)5 h，然后取出烟草植株用蒸馏水洗尽植物表面的残留的NaHuCO3，再分别置于 150 mL 含 50 μ mol Γ1 AlCl3 和不含 AlCl3 的 CaCl2 (0.5 mmol ΛρΗ4·3)溶液中，于25°C恒定光照(100 mmol m_2 s—1)下处理M h，用预冷无菌蒸馏水冲洗植物表面的处理液后，用吸水纸吸去表面水分后将叶片在液氮中速冻并在研钵中磨成粉末，加入4 mL 100 mmol L—1磷酸钾缓冲液(KPB，pH 7. 4)抽提。抽提液在沸水浴处理3 min使酶失活后离心(12000 X g) 10 min去除细胞碎片。上清液被冷冻抽干后溶于0. 5 mL的100 mmol Γ1 KPB缓冲液中，再转移样品至5 mm核磁管，加入2H2O至5% (ν/ν)，并将封入毛细管的甲酰胺插入核磁管中作为内参与样品一起进行13C-NMR分析。13C-NMR分析方法参照Chen等 (Chen LM, Yurimoto H, Li KZ, et al. Assimilation of formaldehyde in transgenic plants due to the introduction of the bacterial ribulose monophosphate pathway genes. Biosci Biotechnol Biochem, 2010，74(3) : 627-635)的方法进行，"C NMR 数据通过布鲁克核磁共振仪(DRX 500-MHz)获得，参数如下宽带质子去耦，5-ms (90° )脉冲， 谱宽37594 Hz，采样时间0.5 s，延滞时间1.2 s，样品温度保持在25° C，每个样品采集 32000个数据点，扫描1200次，处理数据时线宽为4 Hz0样品中各[13C]共振峰的化学位移参照马来酸亚甲基碳原子共振峰(130. 66 ppm)。在计算不同样品中[1-13C]代谢物的相对含量时，目标共振峰以甲酰胺为内参进行积分。用13C-NMR分析有铝胁迫下和无铝胁迫转基因烟草株系(pCSl，rCSl)中CS和PEPC 催化的反应底物和产物的含量变化。用未经任何处理的野生型烟草作为对照检测烟草叶片中各种背景1弋-NMR共振信号的水平(图10E和图11D)，根据预实验结果，首先用NaHuCO3做 5 h的标记实验，通过光合作用的CO2同化途径使葡萄糖和果糖的碳原子被13C标记上(图 10D)，然后再进行有铝(图10)和无铝胁迫(图11)的处理16 h，观察进入糖的1V在有机酸中的分布。结果发现在有铝胁迫下，在双转^和/76 ^基因烟草的13C-NMR共振谱(图10B) 中，PEPC反应的产物OAA的共振信号峰(22. 52 ppm)比WT (图10C)和单转CS基因烟草 (图10A)的强。同时在α和/76·/^双转基因烟草的13C-NMR共振谱(图10B)中，CS反应的产物柠檬酸(Cit)的共振信号峰(70. 13 ppm)也比WT (图10C)和CS转基因烟草(图10A) 的强，说明^的过量表达增加其合成量，使PEPC反应产生的OAA被有效转化成Cit。在α 和/7印c双转基因烟草的13C-NMR共振谱(图10Β)中，苹果酸Mal的共振信号峰(64. 93 ppm) 也比WT (图10C)和α转基因烟草(图10Α)的强，说明PEPC的过量表达也增加其合成量， 可能是由于PEPC的作用生成较多的OAA也有助于Mal的合成。在无铝胁迫下，α和/76·/^ 双转基因烟草的13C-NMR共振谱(图11Α)与WT (图11C)和CS转基因烟草(图11Β)相比差别不大，但是在WT的13C-NMR共振谱中发现丙酮酸(ΡΑ，15.17 ppm)比较强，而在转基因烟草中没有这两种共振峰。实施例10 转基因烟草植株根分泌柠檬酸的测定
选取形态大小相对均一的小苗，分别置于50 mL含300 μ mol Γ1 AlCl3和不含AlCl3的 CaCl2 (0.5 mmol Γ1，pH4. 3)溶液中，于 25°C 恒定光照(100 μ mol m2 下处理 72 h， 每天更换新鲜的处理液，收集处理液浓缩干燥后溶于1 mL蒸馏水中，柠檬酸的分泌量用高效液相色谱(HPLC)测定。对转基因烟草和野生型烟草柠檬酸分泌量的分析结果如图12所示，在无铝胁迫的酸性条件下，rcsl、rcs4和rcsl4转基因植株柠檬酸的分泌量是野生型的 1. 8-1. 9倍，ρ印c2、pepcl4和ρ印cl7转基因植株柠檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 4倍， pCSl、pCS4和pcsl4双转基因植株的柠檬酸分泌量是野生型的2. 5-2. 7倍(图12A)。在300 μ mol L-1AlClJ办迫的酸性条件下，rcsl、rcs4和rcsl4转基因植株柠檬酸的分泌量是野生型的2. 7-3. 3倍，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7转基因植株柠檬酸的分泌量是野生型的1. 3-1. 5 倍，pcsUpcs4和pcsl4双转基因烟草的柠檬酸分泌量是野生型的3. 8-4倍(图12B)。实施例11 转基因烟草植株在铝毒胁迫下根伸长速率的测定
根的相对伸长率(Al3+处理与对照(无Al3+处理)的根系伸长量的百分比。)是衡量植物耐Al性强弱的重要指标，因此我们还测定在铝毒胁迫下转基因烟草植株根相对生长率。 将大小均勻一致的转基因烟草和野生型烟草幼苗，分别置于AlCl3浓度为30 μ mol/L的 CaC12溶液中。处理24小时之后，测量供试植株根的生长量，重复5次。结果表明30 μ mol Γ1的AlCl3处理烟草植株24 h后，野生型烟草根相对伸长量为39%，rcsl、rcs4和rcsl4 转基因植株根相对伸长量为84-90%，ρ印c2、p印cl4和ρ印cl7转基因植株的根相对伸长量为57-64%, pcsl、pcs4和pcsl4双转基因烟草的根相对伸长量为102-115% (图13)。由此可见转双基因植株的铝抗性比单基因烟草和野生型烟草强，其根生长不受抑制。实施例12 转基因烟草植株在铝毒胁迫的沙质土壤中的生长情况分析 将大小均勻一致且生根良好的转基因烟草幼苗以及野生型烟草幼苗移载到新的珍珠
岩基质中，在温室内进行盆栽试验，每星期浇灌含有0.5 mM A1C13的Blaydes培养基营养液两次，六周后观察其生长状况，用卷尺测定株高。用清水将根部的细沙冲洗干净后观测根部生长状况，将根部烘干后测定根部干重。结果显示rcsl、rcs4转基因植株和pcsl、pcs4双基因植株生长良好，并且已经出现花蕾。然而野生型烟草植株生长明显受阻，植株矮小，发育迟缓(14A)。P印c2、p印cl4转基因株系和野生型并没有太明显的差异(图14B)。通过对烟草植株高度的测量发现rcsl、 rcs4转基因烟草的株高为野生型烟草的1. 4-1. 5倍，ρ印c2、pepcl4转基因烟草的株高为野生型烟草的1-1. 2倍，pcsl、pcs4双转基因烟草的株高为野生型烟草的1. 7-1. 8倍(图 14C)。用清水将烟草根部冲洗干净后观察根部的长势，发现rcsl、rcs4转基因烟草和 pcsl、pcs4双转基因烟草根部的生物量明显高于野生型烟草(图15A)。将根烘干后测定其干重发现，rcsl、rcs4转基因烟草的根部干重是野生型的2. 4 2. 5倍，ρ印c2、pepcl4转基因烟草的根部干重是野生型的1. 2 1. 3倍，pcsl、pcs4双转基因烟草的根部干重是野生型的3. 4 3. 7倍(图15B)。
1权利要求
1.一种用于提高植物耐铝毒能力的载体，其特征在于是具有光诱导启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因来源于嗜热蓝藻。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述的来源于嗜热蓝藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC的一个突变体。
4.根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。
5.根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于所述载体中用于构建所属植物表达载体的起始载体为PH2GW7。
6.一种用于提高植物耐铝毒能力的载体的构建方法，其特征在于包括下列技术方案(1)从GenBank中查找嗜热蓝藻PEPC的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物 ρ印c5 :5’ - CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3‘ρ印c3 :5’ - GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3‘5’端引物ρ印c5，末端加CACC特征序列，并由此形成AfcoI酶切位点；3’端引物ρ印c3， 末端加损ol酶切位点；以本申请人构建的一个入门质粒载体pENTR 2B-KsPEPC为模板扩增得到PEPC突变体的全长编码区的DNA片段；(2)回收并纯化PEPC全长基因片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-PEPC ；(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC，用 Nco I 和 Xho I 切割 pENTR*-PrbcS-*T_GFP 和pUCm-PEPC，回收载体pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-PEPC ；(4)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-PEPC亚克隆到植物表达载体PH2GW7中，获得PEPC基因的植物表达载体 pH2-35S-PrbcS-PEPC0
全文摘要
本发明提供一种用于提高植物耐铝毒能力的载体及构建方法，该载体是具有光诱导启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体；通过从GenBank中查找嗜热蓝藻PEPC的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物；回收并纯化PEPC全长基因片段，并将其连接到pUCm-T载体上；构建入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC；构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC。本发明转PEPC和CS基因的烟草植株柠檬酸合成酶活性是野生型烟草的2.4～2.6倍，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性是野生型烟草的2.2～2.4倍。本发明的专用载体能在提高植物对铝毒的耐受性方面发挥很大作用，特别是在中国南方酸性红壤中，可显著促进植物对铝毒的耐受能力，因而也为植物品种改良提供了一条新途径。
文档编号C12N15/82GK102199620SQ201110056779
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者易琼, 李昆志, 玉永雄, 王奇峰, 胡清泉, 赵玥, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学, 西南大学