专利名称：一种洛伐他汀的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种洛伐他汀的制备方法，尤其涉及一种通过发酵法制备洛伐他汀的方法。
背景技术：
洛伐他汀(lovastatin,也称莫那可林K, monacolin K)是一种来源于微生物HMG-CoA(羟甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂，是用于治疗高胆固醇症的药物，它能阻止动脉硬化发展，减少心肌梗塞等发病的危险，因此在医学上具有重要意义。目前生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。目前，生产洛伐他汀所采用的微生物主要有三大类青霉菌、红霉菌和土曲霉，其中土曲霉是工业生产中最常用的菌种。国内对其研究主要集中在提取工艺研究和发酵碳源、氮源优化方面及发酵过程中菌球形态变化。国外对其发酵过程研究主要集中在洛伐他汀生物合成途径及其前体的研究。金属离子及生物素对土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵产生洛伐他汀产量的影响尚未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种洛伐他汀的制备方法，从而有效提高产量，降低生产成本。为实现上述目的，本发明所提供的一种洛伐他汀的制备方法，包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液。根据本发明的一个具体实施方式
，在所述制备方法中，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液或锌离子溶液，使得发酵培养基中生物素浓度为0. 00002%。-0. 0002%。(w/w)或锌离子浓度为0. 5mM-9mM ;优选为发酵培养基中生物素浓度为 0. 00002% -0. 00012%。(w/w)或锌离子浓度为 lmM-7mM。根据本发明的一个优选的实施方式，在所述制备方法中，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液，使得发酵培养基中生物素浓度为0. 00002-0. 0002%。(w/w)和锌离子浓度为0. 5mM9mM ;优选为发酵培养基中生物素浓度为 0. 00006-0. 00012%。(w/w)和锌离子浓度为 lmM-7mM。优选的，在发酵开始后的0_36h过程中，向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液，然后再继续进行发酵。申请人发现，在发酵初期加入已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液，效果较好。其它发酵的条件本领域技术人员可以根据常规发酵方法进行选择。例如，可在发酵药瓶中，以200r/min在26 土 1°C的旋转式摇床中进行发酵180-230 小时。本发明的洛伐他汀的制备方法中，通常还包括在发酵之前将菌种在种子培养基中 进行培养的步骤，然后再将培养后获得的种子液接种于发酵培养基中，进行发酵。优选的，在种子培养基中进行培养的条件为在在温度26±1°C下培养90-96h。优选的，将培养后获得的种子液以5-15%的接种量接种于发酵培养基中。本发明的洛伐他汀的制备方法中，通常还包括在发酵之后对发酵液进行分离提纯的步骤。例如对发酵液进行过滤、萃取、结晶、干燥，以获得洛伐他汀成品。根据本发明的一个具体实施方式
，可以先将菌种接种于种子培养基中，在温度26土 1°C下培养90-96h，然后按10%接种量将培养后获得的种子液接种于发酵培养基中，200r/min，26土 TC旋转式摇床进行发酵，在发酵0-36h过程中，单独添加已灭菌的生物素溶液或锌离子溶液，使得发酵瓶培养基中生物素浓度为0. 00002%。-0. 00012%。(w/w)或锌离子浓度为0. 5mM9mM，或者复合添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液，使得发酵瓶培养基中生物素浓度为0. 00006-0. 00012%。(w/w)和锌离子浓度为0. 5mM9mM。培养216h ；将所得发酵液按常规处理，过滤、萃取、结晶、干燥，即得洛伐他汀成品。本发明中，发酵培养基可以按照常规配制方法进行配制。例如，发酵培养基可以为(按重量百分比计):20%葡萄糖、4%豆柏、0. 5%麦精、1%蛋白胨、0. l%NaCl、0. 05% MgS04、0. 05% KH2P04、0. 1% NaN03、余量为水，pH6. 8。在洛伐他汀的生物合成过程中，首先是乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经LovB、LovC基因编码的聚酮合成酶合成二氢莫那克林L，然后在LovA基因编码的P450加氧酶的作用下将其氧化成中间体莫那克林J。同时LovF基因编码的二酮合成酶则催化乙酸和丙二酸单位缩合为2-甲基丁酰侧链，并在LOvD基因编码的酰基转移酶(AT)的作用下，被转移至莫那克林J分子的C-8位羟基上成为最终产物洛伐他汀。实验发现金属离子Zn2+影响洛伐他汀的生物合成过程中相关酶的活性。本发明中，可以通过向发酵培养基中添加硫酸锌来添加锌离子，也可以通过添加氯化锌等来实现。本申请的发明人在研究提高洛伐他汀产量的过程中惊奇的发现，向土曲霉的发酵培养基中加入金属离子Zn2+和生物素，能提高洛伐他汀的产量。使用本发明提供的方法，通过向洛伐他汀发酵培养基中加入金属离子Zn2+和生物素，无论是单独的加入金属离子Zn2+或生物素，还是加入复合的金属离子Zn2+和生物素，均能显著提高洛伐他汀的生物合成。而且，当发酵培养基中加入金属离子Zn2+和生物素时，金属离子Zn2+和生物素之间能起协同作用，大幅提高洛伐他汀的产量。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。除特别说明外，以下实施例中所使用的％均为重量比。在本发明的实施例中，将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，26±0.5°C摇床转速200转/分，周期90-96小时；按10%接种量接入摇瓶发酵培养基中，发酵培养基按常规配制方法配制，发酵培养基的配方为20%葡萄糖、4%豆柏、0.5%麦精、1%蛋白胨、0. I % NaCUO. 05% MgS04、0. 05% KH2P04、0. I % NaNO3、余量为水，pH6. 8，发酵温度为26±1°C。在本发明的实施例中，洛伐他汀的含量测定采用HPLC，照高效液相色谱法(中国药典2000版二部附录VD)进行检测。
实施例I添加金属离子Zn2+对洛伐他汀产量的影响配制洛伐他汀的发酵培养基，并向洛伐他汀发酵培养基中分别添加ZnSO4,使Zn2+在相应的培养基中的重量比浓度分别为lmM、3mM、5mM、7mM，同时，以不加ZnSO4的洛伐他汀原始发酵培养基作为对照培养基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)发酵培养216小时后，取样测定洛伐他汀的含量。结果如表I所示。 表I、添加ZnSO4对洛伐他汀产量的影响
权利要求
1.一种洛伐他汀的制备方法，包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，在所述制备方法中，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液或锌离子溶液，使得发酵培养基中生物素浓度为O.00002%。-O. 0002%。(w/w)或锌离子浓度为O. 5mM-9mM ;优选为发酵培养基中生物素浓度为 O. 00002% -O. 00012%。(w/w)或锌离子浓度为 lmM-7mM。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在干，在所述制备方法中，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液，使得发酵培养基中生物素浓度为O.00002-0. 0002%。(w/w)和锌离子浓度为O. 5mM-9mM ;优选为发酵培养基中生物素浓度为O.00006-0. 00012%。(w/w)和锌离子浓度为 lmM_7mM。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述发酵条件为在26土TC下发酵180-230 小时。
5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，还包括在发酵之前将菌种在种子培养基中进行培养的步骤，然后再将经过培养的种子液接种于发酵培养基中，进行发酵。
6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法,其特征在于,菌种在发酵培养基中的接种量为5-15%。
7.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，在发酵开始后的0-36h过程中，向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液，然后再继续进行发酵。
8.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，所述洛伐他汀的制备方法，还包括在发酵之后对发酵液进行分离提纯的步骤。
9.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基为(按重量百分比计):20%葡萄糖、4%豆柏、O. 5%麦精、1%蛋白胨、O. I % NaCUO. 05% MgS04、0. 05%KH2P04、0. 1% NaNO3、余量为水，pH6. 8。
10.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法,其特征在于，向发酵培养基中添加锌离子是通过添加硫酸锌或者氯化锌来实现的。
全文摘要
本发明公开了一种洛伐他汀的制备方法，包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤，其特征在于，在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和/或锌离子溶液。本发明的制备方法有效提高洛伐他汀的产量，降低了生产成本。
文档编号C12P17/06GK102676601SQ20111006542
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者刘守强, 张宏周, 时新生, 李武德, 李翠平, 毛全贵, 沈芳, 焦国华, 王文华 申请人:河南天方药业股份有限公司