专利名称：一种棉花抗黄萎病的苗期鉴定方法
技术领域：
本发明属于棉花抗病育种技术领域，具体涉及一种棉花抗黄萎病的苗期鉴定方法，本发明涉及一种利用苗盘移苗蘸根法鉴定棉花苗期黄萎病的抗性，为作物抗病育种提供抗性材料的早期快速鉴定。
背景技术：
棉花黄萎病(Verticillium dahliae. Kleb.)是世界毁灭性土传维管束病害,严重影响棉花的产量和品质，可侵染多种草本作物、木本作物、花卉及木本观赏植物，如草莓、番茄、薄荷、橄榄树、辣椒、油菜、茄子、土豆、向日葵、菊花、玫瑰、枫树等。国内外学者普遍认为，选育和利用抗病品种是防治棉花黄萎病经济而有效的途 径。棉花抗黄萎病鉴定是抗病育种和抗病材料筛选必不可少的环节。因此筛选抗原材料，供育种工作者合理选择亲本，进而选择抗性稳定的品种，供生产上应用显得迫切需要。抗源的筛选，需要进行大规模的棉花种质资源的抗性评价为基础，因而急需建立一种快速，简便，致病力稳定，规范，实用的抗病性鉴定技术。目前棉花抗黄萎病鉴定主要是通过人工病圃鉴定和室内苗期鉴定。人工病圃鉴定被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗病鉴定方法，在抗病育种过程中应用最为普遍。但此鉴定方法受鉴定病圃限制，历时太长，易受气候条件的影响，且具有较强的季节性。棉花苗期鉴定方法简便、迅速、容易控制外界环境条件。常用的有四种，包括针刺法(顾本康，李经仪，棉花黄萎病菌实针接种试验[J]，江苏农业科学，1984，(I) :47.)、纸钵撕底法(石磊岩等，棉花黄萎病苗期鉴定方法，植物保护，1987，(I) :42.)、无底塑钵菌液浇根法(简桂良，孙文姬，马存，棉花黄萎病抗性鉴定新方法-无底塑钵菌液浇根法，棉花学报，2001，13 (2) 67-69)、六棱塑料钵定量注菌液法(马峙英，王省芬，张桂寅，等.河北省棉花黄萎病菌致病性的研究，棉花学报，1997，(9) I :15-20.)。其中针刺法具有强迫接种的特点，不能准确的反应棉苗的抗性；纸钵撕底蘸根法是年代70年代至80年代经过多年试验研究确定的温室苗期鉴定方法，具有快速、准确、易操作等优点，但是制作纸钵费工费时，且在育苗时容易污染。无底塑钵菌液浇根法和六棱塑料钵定量注菌液法的育苗时间长，伤根不均匀，鉴定时间长。四种鉴定方法均有一定的缺点，这是造成苗期鉴定结果与人工病圃鉴定存在显著差异的原因之一。建立快速、准确的鉴定方法，以满足当前棉花黄萎病基础研究与抗病性鉴定的需要，显得十分必要。
发明内容
本发明目的在提供一种鉴定结果稳定、可操作性强、鉴定方便、适合大批量材料进行快速的棉花黄萎病抗性鉴定的接种方法。本发明的技术方案如下一种棉花抗黄萎病的苗期鉴定方法，其特征包括如下步骤I)浸种催芽，采用多孔聚乙烯泡沫育苗盘为载体，以泥炭、草炭和蛭石为培养基质，每个育苗盆配5L营养液；每5L水加250ml基础营养液，再加25ml诱导液母液，在自然光照下进行棉花水浮育苗，培养时间为28-32d，备用；2)将冰箱中试管保存的保藏号为CCTCC NO M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA培养基的培养皿中，之后将培养皿放在恒温箱中进行活化，活化温度为25°C，活化时间为10-15d，取一直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’ s培养基的三角瓶中，于25°C下振荡培养5-6d;3)将步骤2)的病菌培养物用双层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板统计孢子数，用无菌水将孢子调至5X IO6个/ml的孢子悬浮液，待棉苗长到两叶一心时连同基质一起从育苗盘中拔出，用干净的吸水纸将水生根上的水分吸干，然后用剪刀剪去水生根根尖Icm进行伤根处理；将伤根后的水生根全部浸入保藏号为CCTCC NO :M2011095，浓度为5 X IO6个/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液中IOs后立即取出，不使基质散落，且基质不蘸菌；4)在塑料钵中事先铺2. 5-3. 5cm厚的湿润无菌土，将步骤3)蘸菌后的棉苗移栽于塑料钵中，一钵一苗，再用湿润的无菌土覆盖，覆盖深度为离钵缘3-4cm处，之后再覆盖干 燥的无菌土以防其他杂菌的滋生，将塑料钵置于温室中，培养温度为25-28°C ;lh后浇少量的水，防止棉株萎焉，IOd后观察黄萎病的发病情况；其中步骤I)所述的基础营养液配方如下硝酸钾38g/L，硝酸铵33g/L，七水硫酸镁
7.4g/L，磷酸二氢钾3. 4g/L，氯化钙8. 8g/L ;补充蒸馏水至IL ；步骤I)所述的诱导液母液配方如下硼酸1.24g/L，硫酸锰4.46g/L，硫酸锌I. 7g/L，钥酸钠0. 05g/L，硫酸铜0. 005g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸亚铁5. 56g/L，乙二胺四乙酸二钠7. 46g/L ;补充蒸馏水至IL ；步骤2)所述的 Czapek’ s 培养基配方如下FeS040. 02g/L，NaN032g/L，MgS04lg/L，KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;补充蒸馏水至 1L。申请人:从湖北省沙洋县感染棉花黄萎病的棉株上分离得到一株专用于棉花抗黄萎病的苗期鉴定的菌株-大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) 6SY2-37，于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCN0 M2011095。本发明的优点和有益效果在于(I)接种后的棉苗发病迅速，发病显著，可以有效区分不同棉花品种对病菌的抗感型，还能有效的区分不同致病生理型的菌株(2)通过棉苗逐个同一部位伤根、逐个蘸菌进行抗病鉴定，保证了伤根程度一致，接菌量一致，接种后发病均匀，结果稳定性好。其与普通裸根蘸菌法相比的优势在于，普通裸根蘸菌法接菌时需洗去根部的土壤，由于根系在土壤中相互缠绕，盘根错节，这样在洗去根部土壤的同时就会不可避免地损伤根系，伤根程度很难做到统一。另外，普通裸根蘸菌法接菌移栽后的棉苗缓苗期大概需要一个星期的时间，而且子叶容易萎焉脱落，之后的病情调查容易产生误差。苗盘移苗蘸根法的棉苗只是水生根蘸菌，移栽时携带有基质，基本上保持了根系的原貌，移栽成活率高，缓苗期短，最多不超过ld，很少出现子叶的萎焉，保证了病情调查的准确性。(3)本发明接种方法快速简便、规范实用，可用于棉花品种抗病性鉴定和抗病材料的初步筛选、病原菌致病力测定、病原菌生理小种鉴别。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
图I.不同孢子液浓度条件下棉苗发病情况。该图反映的是接菌浓度梯度试验结果。由图I可知，接菌浓度在5X IO5个/ml条件下，鄂棉24、DP410B和银瑞361的病指都很低，达不到抗病鉴定要求。当接菌浓度为I X IO6个/ml时，鄂棉24和DP410B的病指没有显著差异，分别为30. 6和30. 2，银瑞361的病指为14. 9。感病对照病指也较低，不能很好地反映各品种的真实抗性。当接菌浓度为5 X IO6个/ml时，鄂棉24的病指为50. 5，DP410B和银瑞361的病指分别为49. 5和27. 5。鄂棉24和DP410B的病指亦无差异，DP410B 表现为感病，银瑞361表现为耐病。当孢子液浓度为I X IO7个/ml和5X IO7个/ml时，鄂棉24和DP410B的病指相似，各品种的病指都很大，均表现为感病。可见，IX IO7个/ml和
5X IO7个/ml浓度下，菌液浓度过大，不宜用于抗病鉴定，因此，5 X IO6个/ml的大丽轮枝菌孢子液浓度较合适。图2.不同伤根方法棉苗发病情况。由图2可知，伤水生根Icm各品种的病指略低于伤水生根1/2各品种的病指，但差异不明显，都能较好地区分出抗感品种，这表明伤水生根Icm和伤水生根1/2均可。笔者建议选用伤水生根lcm。切除所有的水生根时，各品种的病指都很大，均表现为感病，抗感品种区分不明显。说明此种伤根过重，不宜用于抗病鉴定。图3.各品种病指随接菌后天数变化情况。该接种方法发病迅速，故把握适宜的病情调查时期至关重要。图3反映的是在伤水生根1/2、孢子浓度5 X IO6个/ml条件下鄂棉24和银瑞361的病指随接菌后天数变化情况。一般接菌7d后，各品种子叶陆续显现黄萎病症状。感病对照鄂棉24的病指达到45-55的时期大约在接菌后的第13-16d。多次的重复试验表明，适宜的病情调查时期为接菌后的第13-16d。过早病指偏低，超过此期限感病和抗病材料的病指均偏大，达不到鉴定效果。
具体实施例方式实施例I一、供试材料本发明所用的棉花品种有鄂棉24(湖北省农作物品种审定委员会审定的常规棉花品种，由湖北省黄网市农科院选育并提供种子，该品种已经公开推广，参见网址http://baike. baidu. com/view/2089471, htm), DP410B(湖北省农作物品种审定委员会审定的常规抗虫棉，由美国字棉公司选育，已在中国推广，见网址http: //baike. baidu.com/view/4605450, html tp = 0 10)、银瑞361 (抗虫棉常规品种，山东省德州市银瑞棉花研究所和中国农业科学院生物技术研究所联合选育，在中国推广应用，种子由中国农科院棉花研究所提供，见网址http://www. foodsl. com/content/409310/)。其中鄂棉24在生产上表现感病，DP410B、银瑞361在生产上具有一定抗病性。所用的大丽轮枝菌是6SY2-37，由华中农业大学植物病理实验室提供的强致病力的落叶型菌株。2007年10月从湖北省沙洋县鄂杂棉10号中采集棉花黄萎病病株，采用升汞和酒精表面消毒法进行分离。将病株枝条洗净、切段，在超净工作台中用无菌水清洗2-3次，再用70%的酒精消毒30s，无菌水清洗3-5次。然后用0. I %的升汞消毒2min，用无菌水清洗3-5次，用剪刀剪成小块放入PDA培养基中，25°C恒温培养3-4d，进行病原菌鉴定、菌种保存备用。采用稀释平板法对筛选的菌株进行单孢分离。在培养15d的PDA平板上，用2_3mL的无菌水洗孢子，制成孢子悬浮液，经5层擦镜纸过滤菌丝后，在显微镜下用血球记数板观察，将菌液浓度稀释为4X IO6个/ml，取0. Iml置入水琼胶培养基平板上，均匀散开，培养皿底面划成小方格，置24-25°C温箱中12-24h后镜检，选取方格内只有单个孢子的做好标记，然后按无菌操作挑取方格内培养基，移入PDA平 板上，长出的菌落即为单孢菌系，移入试管斜面，保存备用。根据病原菌菌落的培养性状，形态特征，以及大丽轮枝菌分生孢子梗轮支状；每轮有3 4分枝，含黑色的微菌核等特征，对分离的菌株进行鉴定。菌种鉴定工作参照魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，1979版介绍的方法。大丽轮枝菌6SY2-37的生物学特征分生孢子长卵圆形，单细胞极少分隔，大小为2. 3 9. IX I. 5 3. Oum0分生孢子梗轮枝状，每轮有3 4分枝，全长110 130um，分枝大小13. 8 21. 4 X 2. 3 2. 7um，梗基部无色透明，菌落生长无色菌丝体，生长较长时间菌丝变褐色，有隔膜直径2 4um。菌丝体常呈膨胀状，可由单根菌丝或数根菌丝芽殖形成菌核。不同地区棉花黄萎病菌微菌核形成的数量、大小和性状有明显的差异。将分离筛选的大丽轮枝菌6SY2-37于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :M2011095。二、棉花水浮育苗棉花水浮育苗技术参照陈金湘等报道的方法(陈金湘等.棉花漂浮育苗技术[J].中国棉花，2006,33(11) =24-25.)采用多孔聚乙烯泡沫育苗盘为载体，以混配基质(泥炭、草炭和蛭石的混合物，按照重量比计为草炭泥炭蛭石=1:1: LpH 6-7)为支撑，每个育苗盆中加入以每5L水加250ml基础营养液，再加25ml诱导液母液的比例配制的营养液水体5L作为苗床，进行漂浮育苗。使优良棉种出苗率达到90%以上，育成的棉苗根系发达，生活力强，生长整齐一致，少或无病，无杂草。育苗盘、基质购自荆州市利农水育苗器材有限公司。本发明将育苗盘从中间一分为二成两个小的育苗盘(12个纵排,8个横排)，横排12个穴孔，纵排8个穴孔，共96个穴孔。育苗盆的长、宽、高分别为50cm、35cm、15cm。I、种子催芽选择籽粒饱满、成熟的前面所述的棉花种子，用浓硫酸脱绒。用50°C温水浸种，并加入50%多菌灵可湿性粉剂(来源厂家山东省曲阜市尔福农药厂)至浓度为5mg/ml，浸菌时间为10h，使种子充分吸水。种子充分吸水后，用清水冲洗种子，再浙干多余的水分，放在湿润的双层纱布上，然后再用湿润的双层纱布盖住种子，最后放在恒温箱里，温度设定30 0C，直至种子破胸或露出根尖。2、基质装盘培养基质(来源厂家荆州市利农水育苗器材有限公司，成分为草炭泥炭蛭石=I : I : l,pH 6-7.)在实验进行前用高压锅灭菌I小时(温度121 °C，压强0.6Mpa)。先将基质用水湿润，使基质含水量达到自身重量的60%为宜(即手捏成团，手指间不见流水，下落后自然散开)。再将湿润的基质装入育苗盘的穴孔中，上下抖动育苗盘使穴孔中的基质压实。穴孔中基质表面离盘面I. 0-1. 5cm。3、播种选择破胸或根长相当于半粒种子长度的棉子播种，每穴孔播I粒，根尖朝下，播在穴孔的中间。播完后用基质进行覆盖并压实，基质与育苗孔表面相平。4、营养液的配制每盆配5L营养液。每5L水加250ml基础营养液，再加25ml诱导液母液。基础营养液配方硝酸钾38g/L，硝酸铵33g/L，七水硫酸镁7. 4g/L，磷酸二氢钾3. 4g/L，氯化钙8. 8g/L，补充蒸馏水至1L。诱导液母液配方如下硼酸I. 24g/L，硫酸锰4. 46g/L，硫酸锌
I.7g/L，钥酸钠0. 05g/L，硫酸铜0. 005g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸亚铁5. 56g/L，乙二胺四乙酸二钠7. 46g/L ;补充蒸馏水至1L。5、苗床管理待苗盘出苗整齐后放入育苗盆的营养液中，直至棉苗长至一叶一心或两叶一心(依试验而不同)。根据棉苗长势酌情喷施缩节胺以防止高脚苗。三、棉苗培养采用水浮育苗技术进行棉苗的培养。所用的3个棉花品种各种2盘。四、病菌培养和孢子液的配制将棉花大丽轮枝菌6SY2-37在PDA培养基上活化，活化温度25°C，黑暗生长7_10d后取直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’s培养基的三角瓶中，25°C下振荡培养5_6d。然后，将病菌培养物用双层纱布过滤。显微镜下用血球计数板统计孢子数，稀释并配制成所需孢子浓度。所用 Czapek’ s 培养基配方为IL H20、0. 02g FeSO4,2g NaNO3Ug MgSO4UgKClUg KH2PO4、30g 蔗糖、pH = 6.0。五、接种方法待棉苗长到两叶一心时连基质一起轻轻地从育苗盘中拔出，用干净的吸水纸将水生根上的水分吸干，然后用剪刀水生根根尖Icm做伤根处理。之后将水生根全部浸入孢子悬浮液中(IOs)中立即取出(最好不让基质散落，基质不蘸菌)，随即将棉苗移栽在塑料钵中，一钵一苗。塑料钵中事先铺3cm左右厚的湿润无菌土，将蘸菌后的棉苗放入钵中后再用湿润的无菌土覆盖，覆盖深度为离钵缘3-4cm处，之后再覆盖干燥的无菌土以防其他杂菌的滋生。放到温室，温度控制在25-28°C之间。I小时后浇少量的水，防止棉株萎焉。三个重复。IOd后观察发病情况。六、发病情况调查与统计待感病品种普遍发病时，按表I标准记载各供试品种的发病等级。发病等级分为
0、1、2、3、4五个等级。然后根据发病等级计算病情指数，之后再根据所计算出的病情指数来判断各品种对黄萎病的抗性。棉花抗黄萎病抗性分级标准见表2。表I棉苗病情分级标准
权利要求
1.一种棉花抗黄萎病的苗期鉴定方法，其特征包括如下步骤 1)浸种催芽，采用多孔聚乙烯泡沫育苗盘为载体，以泥炭、草炭和蛭石为培养基质，每个育苗盆配5L营养液；每5L水加250ml基础营养液，再加25ml诱导液母液，在自然光照下进行棉花水浮育苗，培养时间为28-32d，备用； 2)将冰箱中试管保存的保藏号为CCTCCNO :M2011095的大丽轮枝菌6SY2-37转移至盛有PDA培养基的培养皿中，之后将培养皿放在恒温箱中进行活化，活化温度为25°C，活化时间为10-15d，取一直径约4mm的菌块放入盛有50ml Czapek’ s培养基的三角瓶中，于25°C下振荡培养5-6d ； 3)将步骤2)的病菌培养物用双层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板统计孢子数，用无菌水将孢子调至5 X IO6个/ml的孢子悬浮液，待棉苗长到两叶一心时连同基质一起从育苗盘中拔出，用干净的吸水纸将水生根上的水分吸干，然后用剪刀剪去水生根根尖Icm进行伤根处理；将伤根后的水生根全部浸入保藏号为CCTCC NO :M2011095，浓度为5X IO6个/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液中IOs后立即取出，不使基质散落，且基质不蘸菌； 4)在塑料钵中事先铺2.5-3. 5cm厚的湿润无菌土，将步骤3)蘸菌后的棉苗移栽于塑料钵中，一钵一苗，再用湿润的无菌土覆盖，覆盖深度为离钵缘3-4cm处，之后再覆盖干燥的无菌土以防其他杂菌的滋生，将塑料钵置于温室中，培养温度为25-28°C ;lh后浇少量的水，防止棉株萎焉，IOd后观察黄萎病的发病情况； 其中 步骤I)所述的基础营养液配方如下硝酸钾38g/L，硝酸铵33g/L，七水硫酸镁7. 4g/L，磷酸二氢钾3. 4g/L，氯化钙8. 8g/L ;补充蒸馏水至IL ； 步骤I)所述的诱导液母液配方如下硼酸I. 24g/L，硫酸锰4. 46g/L，硫酸锌I. 7g/L，钥酸钠0. 05g/L，硫酸铜0. 005g/L,氯化钴0. 005g/L，硫酸亚铁5. 56g/L，乙二胺四乙酸二钠7. 46g/L ;补充蒸懼水至IL ； 步骤 2)所述的 Czapek，s 培养基配方如下=FeSO4O. 02g/L, NaN032g/L, MgSO41g/L,KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;补充蒸馏水至 1L。
2.一株专用于室内鉴定棉花苗期抗黄萎病的大丽轮枝菌6SY2-37，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO :M2011095。
3.权利要求2所述的菌株在棉花黄萎病鉴定中的应用。
全文摘要
本发明属于棉花抗病育种技术领域，具体涉及一种棉花抗黄萎病的苗期鉴定方法。主要的步骤为首先保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM2011095的棉花黄萎病菌6SY2-37在Czapek’s液体培养基中25℃摇培5d，纱布过滤，通过血球计数板计数，配成5×106个孢子/ml。待水培棉苗长到两叶一心期时，连同基质拔苗，切去1cm水生根，蘸根10s接种，湿土埋入塑料钵中，接菌后立即浇水，防止棉苗萎焉，接种10天开始发病。本发明中接种后的棉苗存活率高，接菌均匀，发病迅速，操作方便，结果稳定性好。此外该方法耗时短，育苗时间短，管理方便，因此适合大批量的材料进行棉花抗黄萎病鉴定和病原菌致病力分化测定。
文档编号C12Q1/18GK102732596SQ201110081889
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者史认辉, 徐飞, 惠慧, 郭小平 申请人:华中农业大学