专利名称：肺孢子菌的特异pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种PCR检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种适用于检测人体内的肺孢子菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
由耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci, PJ)引起的人肺孢子菌肺炎 (Pneumocystis pneumonia,PCP)多见于免疫功能低下或缺陷人群，死亡率极高。随着肿瘤化疗患者、接受免疫抑制剂治疗的器官移植者、自身免疫性疾病患者等高危人群的扩大，特别是1984年发现首例艾滋病以来，其发病率呈急剧增加的趋势。PCP是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因，被视为艾滋病的“标志病”。PCP的早期诊断比较困难，其原因在于患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性；患者少痰，即使采用诱痰法，病原体检出率亦较低；血清抗体检测因健康人群抗肺孢子菌抗体阳性率较高而无临床意义；肺组织活检因创伤较大而难以实行寸。目前现有诊断技术主要有1、病原学诊断查获包囊为确诊依据。收集痰液或支气管分泌物涂片染色后镜检， 虽取材方便但检出率很低。皮穿刺肺活检、支气管镜肺活检开胸肺活检，虽检出率高，但损伤大，因而不常用。此外，该方法对检验人员的业务能力要求较高，人为因素影响大。常用染色方法有姬姆萨、甲苯胺蓝和四胺银染色法等。2、免疫学诊断。由于大多数正常人都曾有过肺孢子虫隐性感染，血清中都有特异性抗体存在，故检测血清抗体的方法一般不用于肺孢子虫病的诊断。3、X线检查。卡氏肺孢子虫肺炎典型病例的X线表现为两肺先出现混合性肺泡及间质性改变，以网状结节状浸润为主，从肺门向外周扩展，当病情进展时，可见肺野斑片状实变影，其间常伴有广泛性或局灶性肺气肿和小段肺不张，以肺的外围最为明显。有的斑片状实变影很快融合成大片状均勻致密的浸润影响，病变广泛而呈向心性分布，与肺水肿相似，这一X线表现具有诊断特异性。但该方法不适于疾病的早期诊断，在临床诊疗中意义不大。
发明内容
本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，包括，DNA裂解液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照；其中，所述DNA裂解液含有Nacl，浓度为 120 200mM ；
Tris-HCl (pH 8. 0)，浓度为 10 30mM ；EDTA,浓度为 1 20mM ；SDS，体积浓度为2%;蛋白酶K，浓度 50 150μ g/μ 1 ；所述PCR反应液成分为IOX反应缓冲液包含浓度为300 600mM的KC1，浓度为50 150mM的 Tris-HCKpH 9. 025 °C )，体积浓度为 0. 5 1. 5% 的 Triton X-100 ；MgCl2,浓度为 15 30mM ；dNTP,浓度为 2 3mM ；特异性引物1，浓度为1 20μΜ;特异性引物2，浓度为1 20 μ M ；Taq 酶，活性为 1 100U/ μ 1 ；其中特异性引物1为PCPF，特异性引物2为PCPR，碱基序列分别为5' -GATGGCTGTTTCCAGTACTC-3‘、5' -GTGTACGTTGCAAAAGCCCA-3‘；所述阳性对照为肺孢子菌线粒体大亚基rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒；所述阴性对照为空白去离子水。进一步地，以上所述的肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，其中所述DNA裂解液含有Nacl，浓度为 150mM ；Tris-HCl (pH 8. 0)，浓度为 20mM ；EDTA，浓度为 IOmM ；SDS，体积浓度为2%;蛋白酶K，浓度 100 μ g/μ 1 ；所述PCR反应液成分为IOX反应缓冲液包含浓度为500mM的KCl，浓度为IOOmM的iTris-HCl (pH 9. 0250C)，体积浓度为 1 % 的 Triton X-100 ；MgCl2,浓度为 25mM ；dNTP,浓度为 2. 5mM ；特异性引物1，浓度为ΙΟμΜ;特异性引物2，浓度为10 μ M ；Taq 酶，活性为 5U/μ 1。以上肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤步骤一、样本的预处理取痰或肺盥洗液标本，加等量lmol/L的Na0H，37°C水浴下10 40min，采用转速为6000r/min离心10 20min，弃上清液，沉淀中加生理盐水1 5ml，震荡洗涤沉淀后，以转速6000r/min离心10 20min，如此重复2 10次，最后得到沉淀物备用；步骤二、样本DNA的提取
在步骤一中得到的沉淀物中加入DNA裂解液100 μ 1，置40 60 V水浴30 70min，升温至100°C煮沸保持10 20min，6000r/min离心1 5min后备用，取1 10 μ 1 裂解后的上清液用于DNA扩增。步骤三、PCR扩增按待检样品数的PCR反应管取PCR反应液与定容的ddH20，混于一管中组成25 μ 1 反应体系，盖紧盖子，在涡旋器上混勻形成反应混合液备用。把配置好的反应混合液分装到PCR反应管中，取阴性和阳性对照各5 μ 1分别加入标记好的管中，然后取样品各5μ 1依次加入并标记好，置于PCR仪中进行扩增。PCR扩增条件为先94°C预变性1 lOmin，之后94°C变性1 10min、55°C退火1 10min、72°C延伸1 lOmin、如此进行20 60次循环；再72°C延伸1 IOmin ；步骤四、PCR产物观察称取琼脂糖，配制1. 5%的琼脂糖凝胶，用电泳液混勻后在微波炉中加热1 10分钟，待琼脂糖完全融化并冷却到40 80°C左右，按终浓度0. 5 μ g/ml加入溴化乙锭，混勻导入制胶模中，在室温下胶凝固。待胶凝固后拔出梳子，在加样孔中分别加样，IOOV电压下电泳10 60分钟，之后在紫外灯下观察结果。若仅有一条300bp的明亮条带，则样品中含有肺孢子菌，反之则无。本发明的有益效果主要体现在本发明的PCR检测试剂盒设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。
下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明图1 :PCR检测肺孢子菌DNA的特异性结果示意图，其中M为标记物，N为阴性对照， P为阳性对照，1 8号分别为烟曲霉菌、隐孢子虫、白色念球菌、巨细胞病毒、弓形虫、大肠杆菌、肺炎支原体及健康大白鼠的肺组织DNA。图2 :PCR检测肺孢子菌DNA的敏感性电泳结果示意图，其中N为阴性对照，P为阳性对照，1 7为1 IO1 1 IO7稀释的肺孢子菌DNA标本。
具体实施例方式本发明揭示了一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒及其检测方法。下面结合实施例详细的进一步说明(一 )、肺孢子菌特异诊断序列肺孢子菌线粒体大亚基rRNA基因，此基因为肺孢子菌的各个种所共有且种间变异最小的一段基因，序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个肺孢子菌种所共有，且同源性大于70%，符合属特异检测标准。其序列为GTGTACGTTGCAAAGTACTCAGAAGAATTGTGGTAAGTAGTGAAATACAAATCGGGCTAGGATATAGCT GGTTTTCTGCGAAAATTGTTTTGGCAAATTGTTTATTCCTCTAAAAAATAGTAGGTATAGCACTGAATATCTCGAGG GAGTATGAAAATATTTATCTCAGATATTTAATCTCAAAATAACTATTTCTTAAAATAAATAATCAGACTATGTGCGA TAAGGTAGATAGTCGAAAGGGAAACAGCCCAGAACAGTAATTAAAGCTCCCCAATTAATATTAAGTGAAATAAAAGT TGTTGGATATCTAAAACAGTTAAGAAGTGGGCTTGGAAACAGCCATC
(二)、PCR检测试剂盒的组成(1) DNA 裂解液含不同浓度的Nacl、Tris_HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；各浓度配比为 Nacl 120mM、Tris-HCl (pH8.0)15mM、EDTA 5mM、SDS 1% (w/v)和蛋白酶 K 200 μ g/ μ 1 ；O) PCR 反应液IOX反应缓冲液(不含MgCl2)；浓度为25mM的MgCl2 ；浓度为2. 5mM的dNTP ；浓度为10 μ M的特异性引物1 ；PCPF ；浓度为10 μ M的特异性引物2 ；PCPR ；活性为5U/ μ 1的 Taq酶。采用各组分单独包装，使用时进行配置。其中，反应缓冲液包含浓度400mM的KCl，浓度150mM的iTris-HCl (pH9. 025°C )，体积浓度为1 %的Triton X-100 ；特异性引物1 为碱基序列 5' -GATGGCTGTTTCCAGTACTC-3‘的 PCPF，特异性引物2 为碱基序列 5' -GTGTACGTTGCAAAAGCCCA-3‘的 PCPR ；(3)阳性对照1支肺孢子菌线粒体大亚基rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒。(4)阴性对照空白去离子水。(三、)PCR 扩增取10个样本，1标号为N，为阴性标准品，2标号为P，为阳性标准品，待测样本编号 1 8，分别为烟曲霉菌、隐孢子虫、白色念球菌、巨细胞病毒、弓形虫、大肠杆菌、肺炎支原体及健康大白鼠的肺组织DNA。用建立的扩增体系分别对其进行PCR扩增。其中扩增体系为25 μ 1反应体系，包括以下溶液，
权利要求
1.肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，其特征在于包括，DNA裂解液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照；其中，所述DNA裂解液成分为Nacl，浓度为 120 200mM ；Tris-HCl (pH 8. 0)，浓度为 10 30mM ；EDTA，浓度为1 20mM ；SDS，体积浓度为2% ；蛋白酶K，浓度50 150yg/yl ；所述PCR反应液成分为IOX反应缓冲液包含浓度为300 600mM的KCl，浓度为50 150mM的Tris-HCl (pH 9. 025 0C )，体积浓度为 0. 5 1. 5% 的 Triton X-100 ； MgCl2,浓度为 15 30mM ； dNTP，浓度为2 3mM ； 特异性引物1，浓度为1 20μΜ; 特异性引物2，浓度为1 20μΜ; Taq酶，活性为1 100U/μ 1 ；其中特异性引物1为PCPF,特异性引物2为PCPR，碱基序列分别为 5 ‘ -GATGGCTGTTTCCAGTACTC-3‘、 5 ‘ -GTGTACGTTGCAAAAGCCCA-3‘；所述阳性对照为肺孢子菌线粒体大亚基rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒； 所述阴性对照为空白去离子水。
2.根据权利要求1所述的肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，其特征在于 所述DNA裂解液成分为Nacl,浓度为 150mM ； Tris-HCl (pH 8. 0)，浓度为 20mM ； EDTA，浓度为 IOmM ； SDS，体积浓度为2% ； 蛋白酶K，浓度lOOyg/y 1 ； 所述PCR反应液成分为IOX反应缓冲液包含浓度为500mM的KCl，浓度为IOOmM的Tris-HCl (pH 9. 025°C )，体积浓度为 1 % 的 Triton X-100 ；MgCl2,浓度为 25πιΜ ；dNTP，浓度为 2. 5mM ；特异性引物1，浓度为ΙΟμΜ;特异性引物2，浓度为10μΜ;Taq酶，活性为5U/y 1。
3.一种如权利要求1所述的肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于 包括以下步骤步骤一、样本的预处理取痰或肺盥洗液标本，加等量lmol/L的Na0H，37°C水浴下10 40min，采用转速为 6000r/min离心10 20min，弃上清液，沉淀中加生理盐水1 5ml，震荡洗涤沉淀后，以转速6000r/min离心10 20min，如此重复2 10次，最后得到沉淀物备用； 步骤二、样本DNA的提取在步骤一中得到的沉淀物中加入DNA裂解液100 μ 1，置40 60°C水浴30 70min，升温至100°C煮沸保持10 20min，6000r/min离心1 5min后备用，取1 10 μ 1裂解后的上清液用于DNA扩增； 步骤三、PCR扩增按待检样品数的PCR反应管取PCR反应液与定容的ddH20，混于一管中组成25 μ 1反应体系，盖紧盖子，在涡旋器上混勻形成反应混合液备用；把配置好的反应混合液分装到PCR反应管中，取阴性和阳性对照各5 μ 1分别加入标记好的管中，然后取样品各5μ 1依次加入并标记好，置于PCR仪中进行扩增；PCR扩增条件为先94°C预变性1 lOmin，之后94°C变性1 10min、55°C退火1 10min、72°C延伸1 lOmin、如此进行20 60次循环；再72°C延伸1 IOmin ； 步骤四、PCR产物观察称取琼脂糖，配制1. 5%的琼脂糖凝胶，用电泳液混勻后在微波炉中加热1 10分钟， 待琼脂糖完全融化并冷却到40 80°C左右，按终浓度0. 5 μ g/ml加入溴化乙锭，混勻导入制胶模中，在室温下胶凝固；待胶凝固后拔出梳子，在加样孔中分别加样，100V电压下电泳 10 60分钟，之后在紫外灯下观察结果；若仅有一条300bp的明亮条带，则样品中含有肺孢子菌，反之则无。
全文摘要
本发明提供了一种肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液，PCR反应液，阳性对照，阴性对照，并通过样本的预处理，样本DNA的提取，PCR扩增及PCR产物观察步骤提供了肺孢子菌的特异PCR检测试剂盒的检测方法，本发明的PCR检测试剂盒设计严谨，同时，此检测方法操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。
文档编号C12Q1/68GK102181541SQ201110086848
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者孟维娜, 郭增柱, 郭敏敏 申请人:孟维娜