组蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的应用的制作方法

文档序号:395296阅读:627来源:国知局
专利名称:组蛋白去甲基化酶基因OsJ5在提高水稻抗性中的应用的制作方法
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域。与转基因水稻领域相关。具体涉及一个水稻组蛋白去甲基化酶基因0SJ5的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与提高水稻抗性有关。
背景技术
真核基因的表达受细胞核内、外多层次的调节,呈现多级调控包括遗传调控(genetic regulation)和表观遗传调控(epigenetic regulation)。表观遗传是指不直接受DNA序列控制的基因发生表达或功能的变化并可以遗传的现象,其实质在于染色质 结构的动态变化对基因表达的影响,由于它不涉及基因序列的改变,不符合孟德尔遗传的遗传方式,是一种全新的遗传机制。常见的表观遗传现象包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑、遗传印记、X染色体失活、RNA调控、转座元件等(Levenson JM and SweattJD. Epigenetic mechanisms in memory formation. Nat Rev Neurosci, 2005,6 :108-118)。细胞对外界环境做出的每一个反应,都要调节某些基因的表达,这几乎都会涉及到染色质活性的变化,染色质活性的变化往往就是通过修饰组蛋白实现的。组蛋白氨基末端的修饰包括磷酸化、泛素化、甲基化/去甲基化、乙酰化/去乙酰化等,这些修饰产生的各种标记的组合就形成了所谓调节染色质结构和基因组表达的“组蛋白密石马,,(Jenuwein T and Allis CD. Translating the histone code. Science, 2001,293 1074-1080)。其中组蛋白的甲基化修饰对植物的生长发育起着重要的作用。组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase, HDM)是近几年发现的一类组蛋白修饰酶(Klose et al.,JmjC-domain—containingproteins and histone demethylation. Nat Rev Genet.2006,7 715-727)可以去除被甲基化修饰的组蛋白尾部的甲基,与组蛋白甲基转移酶(HMT)的功能相反。含有Jumonji C(JmjC)结构域的基因是在人类中新发现的具有组蛋白去甲基化酶功能的一类基因,并且具有位点特异性(Klose et al. ,Regulation of histone methylationby demethylimination and demethylation. Nature reviews. 2007,8 :307-318.)。随着研究的深入,越来越多的这类蛋白的成员被发现,功能也越来越丰富。植物中,对jumonji家族功能报道最早的是在2004年发表的调控拟南芥开花的EARLY FLOWERING 6 (ELF6)和 RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6(REF6)(Noh et al. , Divergent Roles of a Pairof Homologous Jumonji/Zinc-Finger-Class Transcription Factor Proteins in theRegulation of Arabidopsis Flowering Time. The Plant Cell. 2004,16 :2601-2613.)。水稻的一个基因JMJ706证实具有去除H3K9 二甲基化和三甲基化的活性,其突变体呈现花形态的变异以及种子胚乳的异常,实验证明它可能通过调控花发育相关的基因MADS47和DHl的组蛋白修饰水平并促使其表达造成花发育的异常(Sun and Zhou. Rice jmjCdomain-containing geneJMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment. PNAS. 2008,36 :13679-13684)。水稻基因组中有 20 个 jumonji 基因,除JMJ706外其它基因的功能都未知,这样我们就更有有理由相信,此类基因在水稻的表观遗传调控和生长发育中占据着重要的地位,相关发面的研究也具有一定的科研和应用价值。

发明内容
本发明的目的是克隆并鉴定一种新的水稻组蛋白去甲基化酶基因0sJ5及其编码蛋白。通过转化水稻本身,培育一种能够提高水稻抗性的转基因水稻。本发明通过以下技术方案实现申请人:克隆得到水稻组蛋白去甲基化酶基因0sJ5,其核苷酸序列如SEQ NO 1中第123-3983所示。本发明的组蛋白去甲化酶基因0sJ5的编码基因(SEQ ID NO 1)来源于水稻,由4145个碱基组成,推测的蛋白质编码序列有3861个碱基,是序列I自5’端第123位碱基到3983位碱基组成。将该基因的完整编码序列(Coding sequence)构建到超表达载体PU1301(见图1),获得转化载体pU1301-0sJ5后直接转入水稻,转基因植株在分孽期开始逐渐出现假病斑,在孕穗期接种白叶枯病发现转基因植株比对照野生型要抗病许多(见图3)。检测转基因植株的组蛋白修饰情况发现,转基因植株的组蛋白H3K36三甲基化和H3K93三甲基化水平要明显低于野生型(见图6)。表明本发明的组蛋白去甲基化酶基因0sJ5可 以调控水稻组蛋白甲基化修饰并且提高水稻对白叶枯病的抗性。具体操作步骤如下(I)从 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)得到 0sJ5 基因(登录号AK068952)的核苷酸序列,根据该序列设计引物对,扩增特异的片段区域(其核苷酸序列见SEQ ID NO 1所示,其中123-3983bp是编码区),所述引物对的DNA序列如下0XJ5-F (正向引物)5 ’ GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC—3,0XJ5-R (反向引物)5 ’ GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT------3 ’(2)将⑴中扩增片段连接到pU1301(见图1),获得转化载体roi301-0sJ5。(3)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y et. al. , Efficient transformationofrice(Oryza sativaL. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA. PlantJ. 1994,6 :271-282)将所述的载体导入水稻受体中花
11(来自中国农业科学院作物科学研究所),获得转化植株;(4)借助Northern Blot方法分析鉴定阳性转基因植株,并初步观察统计转基因植株表型;(5)利用RT-PCR方法分析水稻内源0sJ5基因表达模式;(6)利用realtime-PCR分析转基因植株中相关基因的表达;(7)借助Western Blot分析转基因植株组蛋白修饰情况;(8)转基因植株接种白叶枯菌株PX099,并进行抗性统计。本发明优点如下本发明组蛋白去甲基化酶基因0sJ5在提高水稻抗性中的功能在国内外未见报道,对组蛋白去甲基化酶功能的研究和表观调控对水稻抗性的研究起着重要的意义。目前在水稻中还未有去组蛋白H3K36三甲基化酶基因的报道,本发明0sJ5可以去除组蛋白H3K36三甲基化的功能对组蛋白修饰酶基因分子功能的补充有重要的生物学意义。超表达OsJ5转基因植株可以提高水稻对白叶枯病的抗性,这对水稻抗白叶枯病的研究有重要的指导意义,可以在分子水平上揭示抗病机理。并可以为进一步的应用于农作物品种改良打下良好的基础,对保障中国粮食安全具有重要意义。


序列表SEQ ID NO I :是本发明克隆的水稻组蛋白去甲基化酶的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。序列全长为4145bp,其中123-3983bp区域是编码区。图I :是本发明构建的超量表达载体TO1301示意图。图2 :是0sJ5基因在Tl代超表达转基因植株中的表达量检测。中花11为阴性对照,图中1-1,2-5,3-9,4-2为转基因阳性植株,2-2为转基因阴性植株;图3 :是0sJ5基因超表达转基因植株叶片的形态表型及转基因植株接种白叶枯菌株PX099 15天后的表型。图3A为超表达转基因植株在自然条件下孕穗期时叶片的表型 图;图3B为超表达转基因植株在孕穗期接种白叶枯菌株PX099 15天后的叶片表型。中花11为阴性对照,图中1-1,2-5,3-9,4-2为有表型植株的叶片,2-2为转基因无表型阴性植株的叶片。图4 :0sJ5基因的表达模式。图中是0sJ5基因在水稻愈伤、芽、根、茎、幼穗、剑叶、幼叶中的表达模式,actin为内参。图5 0sJ5基因超表达转基因植株叶片中hAT和HSR201的表达情况。图5A为超表达转基因植株中hAT的相对表达水平;图5B为超表达转基因植株中HSR201的相对表达水平。中花11为对照材料,图中1-1,2-5,4-2为0sJ5基因超表达转基因的Tl代材料,actin为内参;
图6 :0sJ5基因超表达转基因植株的组蛋白修饰。Western Blot实验用的一抗分别为H3抗体,三甲基化H3K9抗体,三甲基化H3K36抗体;所检测的蛋白分别为中花11和0sJ5基因超表达转基因Tl代材料2-5的组蛋白。图7:转基因植株接种白叶枯菌株PX099病情统计。孕穗期采用剪叶法接种白叶枯病菌PX099 (菲律宾菌系生理小种),每株接种5片完全伸展的叶子,接种后15天调查病斑长度,依据病斑面积(病斑长度/病叶长度)衡量病情。中花11为对照,1-22为0sJ5超表达转基因Tl代材料,正体字标注的为分离出的转基因阳性植株,下划线标注的为转基因阴性植株;
具体实施例方式实施例I 0sJ5基因片段克隆对本发明所需要的基因(登录号AK068952, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/32978976),主要通过RT-PCR方法(参见J.萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯著,黄培堂,王嘉玺等译,分子克隆实验指南(第三版),北京,科学出版社,2002版)进行扩增得到0sJ5特异的一段序列,具体步骤是先抽提来自孕穗期植株叶片的RNA,RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书);RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下①配混合液I 总RNA 2 u g, DNAse12u,IOx DNAseI buffer I yl,加DEPC (焦碳酸二乙酯,RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01%DEPC)到10 u 1,混匀后将混合液I在37°C放置20分钟以除去DNA,②20分钟后将混合液I置于70°C水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性,然后置于冰上5分钟,③向混合液I中加入Iyl 500 u g/ml的oligo (dT),④将冷却的混合液I立即置于70°C水浴中温浴10分钟,以彻底使RNA变性,然后置于冰上5分钟,⑤配混合液2 :混合液110 yl,5x firststrand buffer 4 u 1,0. IM DTT (疏基乙醇)2 u I, IOmM dNTP mixturel. 5 u 1,DEPC 处理水0. 5u I,反转录酶2 ii I,混匀后将混合液2置于42°C水浴锅内温浴I. 5小时,⑥反应结束后将混合液2置于90°C干浴3分钟,⑦_20°C保存反应最终产物,反应中用到的试剂全部购自Invitrogen 公司;然后根据 NCBI 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)公布的 0sJ5 基因的全长cDNA序列,设计特异引物PCR扩增特异片段。PCR用到的体系为20 U 1,具体配法为cDNA 第一链模板 I ii 1,IOxPCR buffer 2u I, IOmM dNTP I. 6u 1,2. 5mMMg2+l. 5u I,0XJ5-F 和 0XJ5-R 引物 0. 4 ill,TAQ 酶 0. 2 ill,加水到 20 ill (所用至Ij 的 PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)JCR反应条件如下①94°C 4分钟,②94°C 30秒,③60°C 30秒,④72°C 4分钟,⑤从②-④循环30次,⑥72°C 7分钟,⑦4°C保存。最后将扩增产物连接到T/A克隆载体pGEMT-vector (购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司,即美国Promega公司)上用17和SP6引物测序验证。用来克隆0sJ5的全长片段的引物为 0XJ5-F (正向引物)5,一GGGGGTACCATGAGGCCCTCGCCGCCTCC—3, 0XJ5-R (反向引物)5 ’ GGGGGATCCTCAACTCTTTGCTTTCTTCTTCT—3 ’最终得到的0sJ5基因的全长cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1中第123-3983位所示。实施例2超表达载体PU 1301-Os J5的构建具体步骤如下I)将带有0sJ5片段(如序列表SEQ ID NO : I中第123-3983位所示)的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切,回收目标条带,与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒TO1301 (见图I)连接,pUl301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIAl301 (Sun等,2004,Xa26,a geneconferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice, encoding a LRRreceptor kinase-like protein. Plant Journal. 37 :517-527)基础上改造的,是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。PCAMBIA1301载体由澳大利亚 CAMBIA 实验室(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠赠。内切酶KpnI和BamHI和连接所使用的T4连接酶均购自宝生物工程大连有限公司,用法及用量按照该公司提供的产品说明书;2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为印pendorf公司产品,所用电压为1800v,操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司,即美国Promega公司),在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA (LA配方参见J.萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯著,黄培堂,王嘉玺等译,分子克隆实验指南(第三版),科学出版社,2002版)LA抗性培养基上涂皿培养;3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的IOml离心管,管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基,然后在37°C摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》,J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著,黄培堂等译,科学出版社,2002)所述的方法抽提质粒,用KpnI和BamHI酶切和PCR检测,根据插入片段的大小获得阳性的超表达质粒载体将其命名为PU1301-0sJ5 ;
4)把步骤3)的超表达载体PU1301_0sJ5通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数按照本实施例步骤2)的方法进行)导入农杆菌EHA105(购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。将转化后的菌株命名为T-0sJ5 ;实施例3双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测具体步骤如下I)将T_0sJ5向水稻受体品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)转化,转化方法参照 Hiei 等人报道的方法(Hiei 等,Eff icient transformation of rice (Oryzasativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant J,1994,6 :271-282)进行。所获得的TO代转基因植株命名为0sJ5_n,其中n = 1,2,3…代表转基因的不同家系。
2)取TO代转化植株叶片抽提总DNA,DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等,geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis, 1992, Theor Appl Genet,83,495-499)。然后用 PCR 方法对 TO 代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下Hn_F 5’ -agaagaagatgttggcgacct-3’,Hn-R 5’ -gtcctgcgggtaaatagctg-3’(上海生工生物工程技术有限公司合成)。PCR反应总体积为 20 u 1,具体配法是模板 lOOng,IOxPCR buffer 2u I, IOmM dNTP I. 6u 1,2. 5mMMg2+L 5 iil,左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0. 4yl,TAQ酶0. 2 yl加去离子水到20 yl (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下①940C 4分钟,②94°C 30秒,③56°C 30秒,④72°C 2. 5分钟,⑤从②_④循环32次,⑥72°C 7分钟,⑦4°C保存。PCR产物在I %的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有,这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。对TO代阳性植株收种子(Tl代),为Tl代的大田种植和性状调查做准备。3)为了检测转基因植株中目标基因的表达量,申请人采用Northern-blot的方法对转基因TI代植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的水稻叶片,RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)!Northern转膜上样量为15-20 yg,探针标记采用随机引物标记的方法,所使用的同位素标记物为a-32P-Dctp,膜在杂交管中先预杂交3个小时左右,然后加入同位素标记的探针,继续杂交12个小时;杂交结束后,用2X柠檬酸钠缓冲液(SSC),0. I %十二烷基硫酸钠(SDS)常温下将杂交膜漂洗10分钟,然后用同样的洗膜液在65°C漂洗,每次两分钟,直到信号值合适为止。洗完膜以后将膜置于干净的滤纸晾干,用保鲜膜包好,然后用磷屏(Phosphorimage,FUJI,日本)压片4-6小时最后用FUJIFILMFLA5100扫描读取结果。在本实施例中,获得转基因植株的方法采用农杆菌介导的遗传转化方法(文献参见Hiei et al. , Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J,1994,6 :271-282)报道的主要步骤,培养基以及使用的试剂主要参照华中农业大学授权专利(专利号ZL200710053552. 9,发明的名称水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用;专利
公开日2008年6月18日;
发明者周道绣, 李甜甜 申请人:华中农业大学
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