一种新型耐热β-琼胶酶AgaXa及其制备方法和应用的制作方法

文档序号:396002阅读:235来源:国知局
专利名称:一种新型耐热β-琼胶酶AgaXa及其制备方法和应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种β -琼胶酶AgaXa。具体的说,涉及一种来源于Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶基因叫沾3编码的一种新型琼胶酶Agafe及其基因克隆、原核表达、产物的制备及重组琼胶酶agaXa的应用。
背景技术
琼胶酶可以降解琼脂糖,其主要来源是海洋微生物。根据作用方式的不同,可以分为两类(1) α-琼胶酶,专一降解琼胶中的α-1,3糖苷键,生成以3,6_内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖系列;(2) β-琼胶酶,专一降解琼胶中的β_1,4糖苷键,生成以 β -D-半乳糖为还原性末端和以3,6-内醚-β -L-半乳糖为非还原性末端的新琼低聚糖系列。目前所报道的琼胶酶中绝大多数属于β-琼胶酶,很少有α-琼胶酶。多年的研究和实践证明,琼胶降解产物不同聚合度的琼胶寡糖具有多种生理活性,在医药、化妆品、食品工业及农业等方面具有重要的应用价值。比如新琼寡糖具有抗氧化性、抑制癌细胞的发生、 抗病毒等特殊功能,可以作为食品添加剂;具有细胞增白和保湿功能,可作为化妆品的添加剂等等。传统的酸法降解琼胶法生产琼胶寡糖反应剧烈、工艺条件难以控制,专一性差,水解产物容易被破坏,因此逐渐被反应调件温和、专一度高和高效的酶解法所代替。此外,由于琼胶是某些红藻细胞壁的重要组成成分,琼胶酶亦可用作大型海藻酶解的工具酶来获得单细胞或原生质体。在分子生物学实验中,可利用琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA。 因此高活性、高稳定性的琼胶酶在具有很大的工业应用价值。

发明内容
本发明得到β -琼胶酶基因agaXa,并通过基因工程技术获得其重组蛋白,该序列编码的蛋白质在回收琼脂糖凝胶中的DNA、制备低聚琼胶寡糖、海藻工具酶及海藻多糖结构的研究等方面有广泛的应用。本发明的目的是提供一种来源于feimira^/ sp. X3的一个琼胶酶基因agaXa 编码的一种新型琼胶酶Agafe及其制备方法和应用。本发明通过构建细菌feimira^/ sp. X3的部分基因组文库的方法获得了一种 β -琼胶酶基因agaXa,其编码了 Catenivulum sp. X3的一个琼胶酶AgaXa。其核苷酸序列为:ATGAAACTATTGAATAAGTTTTCTCGTGCTCAGCTTTTCGGATTACTCGCGGGCGTATGTTGTTCAACCACAGC CGTTCAAGCAGCAACTTTTACCGTATACAACGAAACCCAATTAAATAACGCATTAACTTCTGCGCAAAATAATGGCC TAGATACTTTAGATACAATAAAGATCAGCGGTACTATTAACATTTACGGACAAATAGATATTAAGTCATCTGTAAAA ATTACTGGTGCTCAAACAAACAGAGCGTCAAAATTAACTAGACGCAACACAGGCTTTTACAACCCGCTCATTAACGT ACAATACAAAAACGTAACGGTTGAAAATATTACGCTTGAAGGTATTGGTGCGAACACTAATCAGCAATTATTATCTT TAGCTGGTGATGATACCAGCAACAGTGCATTGATTAACTTACCCGCAACTGCTTATGCTACTAACCCGAAAGGTTTT ACTGCAACAAATGTTAACTTTTTTGATAGTGCAATAGGTGTTGCATCTGTAGGCATATTGCCACAAGACTTAAACGT TTCTTACAATACTTTTAGAAATATTAACCGTGCAGTGGAGCTTTTACGTGACGTTGACCGTGTAGATGATGCACTTTTAAATAACGCTCAAATTAAAGTAAACGGCAATATTATTGGTTTGTATGGCGGGAAGTTAAATATTTCAAATAACTTA ATTAACGCTGAAAACATGCGTTTGGCGATATCTTTAGACGGCGGCAACGATGGTGCTGGTTTTATTGGCTCAGGCTT TTTAAACCCTTGGTCTGAAAAACGCCAAACCTATACCGACAAGCCCGTTTATTATTCAAGCGTAATTGGTGAAGCGG TTATCAATAACAACCGTATTGGTTATTATCAACACACAGACGGCGCAGTATGGACTGTTGGTCAAACTCGTGAATTT GGTATCGCACTTGCAACAGTTGCGAATATTTATGTAGTCGGTAACCATGTAAGAACTGGTTTAAACTTTGTAACGCA AGGTGACGGTGTCACGCCAGTAAACAATGCAAGTTTCGGCTTTGGCTCTGCAATTAATGTTGAACACAATGGCGAAA ACATTGTAATTCAAAGCAACCATATTCATGTTGGTGCAAAAGGCAATGGTGCAAATGCTTTTACTATTTTGGCGTTT AACGACCACGGCGCATATTGGAATTTAGCTCAAACCTCTAAAAACCTAACATATGCAAACAACGTGATTAGTGGCAG TGGTGCAAATGTGTTTTATGCGATTGGCTACAGAAACTTAAACATGCTTAATAACGATGTACGTAACTTTAGCTCAA GTGGTGCAGTATTCGGCTGTGGTGGTGTGGTATCCCCTATCAATAACTTTTTAGCGAATGTCCCTGGTGGTTATAGC AATAGCTATATTGAACAAAACCCAGCTACCCATGGTCGTTTATGGTTTGATGCTGTGCGAAATAATGGCCAAGTAGT CGGCGCATTTACCGGTCAAGGTTCAAGAGCGCCACGCTCGTTTTATTACTTGTCAGGAGACGATCCGAAAAATCCAA GATTTGGCGATGCCCAAGTAGTGGATTCAGTCAGTATTATGGGTTGTAATTAA。将本发明的β -琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌克隆载体pBSK-agaXa。将本发明的β -琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌重组菌DH5 α -pBSK-agaXa0将本发明的β -琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌表达载体pET32-agaXa。将本发明的β -琼胶酶基因agaXa用于制备大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa。将本发明的β -琼胶酶基因agaXa用于制备重组β -琼胶酶AgaXa。本发明的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-aga)(a能够大量的表达重组β-琼胶酶AgaXa。并可以通过亲和层析纯化。可以得到大量纯度高的重组β-琼胶酶AgaXa。将本发明的重组β-琼胶酶Agafe用制备不同聚合度的新琼寡糖。本发明中的 β -琼胶酶Agafe可以降解琼脂糖产生聚合度为6-14的新琼寡糖。将本发明的重组β-琼胶酶Agafe用于回收琼脂糖凝胶中的DNA。


下面通过实例对本发明进行说明,以帮助普通技术人员进一步理解本发明。图1是β -琼胶酶基因agaXa的核苷酸序列。图2是根据β -琼胶酶基因agaXa的核苷酸序列推测的氨基酸序列。图3是大肠杆菌重组菌BL21-pET32_agaXa。图4是纯化的重组β-琼胶酶Agafci的SDS-PAGE分析,图中为Μ: Marker, P:纯化后的琼胶酶AgaXa,其分子量为52kDa。
具体实施例方式实验通过构建部分基因组文库的方法从产琼胶酶细菌feimira^/ sp. X3中克隆其琼胶酶基因,利用生物学软件对基因进行分析;利用基因工程手段构建琼胶酶基因的原核表达工程菌,再通过亲和层析技术纯化得到重组酶;并对该琼胶酶的酶学特性、降解产物、该重组琼胶酶的应用进行研究。M取Catenivulum sp. X3从汕头市沿海分离得到,并通过其16S rRNA鉴定 (GenBank 登录号GU975^8)。
实施例1 β -琼胶酶AgaXa的克隆
通过I和历/ d III这两种酶双酶切Catenivulum sp. X3的总DNA,回收细菌基因组酶切后长度为3-71Λ大小的基因片段,与经过同样酶切的pBluescript II SK(+)载体连接,构建细菌的部分基因组文库。筛选在平板上具有琼胶酶活性的阳性克隆子,送北京华大公司测序。通过生物软件DNASTAR分析得到一个基因完整的开放阅读框。通过生物软件Primer5. 0设计正向引物(5,-GCGCGGATCCATCAAACTATTGAAT-3')和反向引物 (5,-GGCCTCGAG AATTACAACCCAT-3,),以基因组 DNA 为模板,进行 PCR。反应体系(25 μ L) :1 μ LDNA模板,1 μ L正向引物,1 μ L反向引物,9. 5 μ L双蒸水, 12. 5μ L 高保真 PCR mix。反应条件95°C预变性5min,然后 95°C 30s,50°C 30s, 72°C lmin30s,32 个循
环。反应结束后整体延伸lOmin。将PCR产物通过试剂盒回收得到β -琼胶酶基因agaXa (图1 )。该琼胶酶基因agafci包含1590bp,编码5 个氨基酸(图2),等电点为7. 79,含有一个观个氨基酸残基的信号肽序列,信号肽的切割为点为了第观和四位的两个丙氨酸之间。除去信号肽后该琼胶酶的推测分子量大小为53. 7 KDa0实施例2 大肠杆菌表达载体pET32-agaXa的构建,由实施例1所得到的β -琼胶酶基因agaXa以及表达载体pET3h ( + )分别用汉I和损ο I进行双酶切条件如下
反应体系(20μ L)双蒸水 10μ L,IOXK Buffer 2yL,基因 agaXa DNA [pET32a ( + ) 质粒DNA]6yL,Sa H I v. L, Xho I 1 μ L,在37°C下酶切2小时。电泳后分别回收大小约为 1. 5kb和5. 9kb的目的片段。二者分别为β -琼胶酶基因agaXa以及表达载体pET3h( + )。然后用T4连接酶将二者连接,反应条件如下
反应体系(20yL)双蒸水9yL,1.5kb片段2yL,5.9kb片段6yL,10XT4连接酶Buffer 2yL,T4连接酶1 μ L,在16 °C下酶连8小时以上,得到大肠杆菌表达载体 pET32_agaXa。实施例3 大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa的构建。取由实施例2得到的重组载体pET32_agaXa 10 μ L加入到100 μ L BL21感受态细胞中,冰上放置30min ;然后放入42°C热激90秒;快速将EP管转移到冰浴中15min ;然后每管加入700 μ L LB培养基,将管转移至37°C摇床,缓慢振摇60min使细菌复苏;取50 μ L复苏后的菌液涂布于含Amp以及X-Gal和IPTG的固体LB平板上;倒置平皿,于37°C恒温培养Mh ;最后挑取白色单菌落用于PCR检测。在琼脂糖电泳中显示1. 5kb大小的特异条带的即为含有pET32_agaXa的大肠杆菌重组菌BL21_pET32_agaXa (图3)。实施例4 重组β -琼胶酶AgaXa的制备。在液体LB (含IOOyg /mL的氨苄青霉素)培养基中按1%比例接入培养过夜的由实施例3得到的大肠杆菌重组菌五coli BL21 (DE3)-pET32-agaXa菌液,在37°C培养至OD600=O. 6后加入0. lmmol/L异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)及0. 01%脱氧胆酸钠 (DOC),于25°C温度进行诱导发酵20h。发酵后,得到的初酶液直接用30 75%的硫酸铵梯度沉淀蛋白质,分离得到的蛋白质在2mmol/L的磷酸缓冲液中透析去离子,透析后的酶液用聚乙二醇20000浓缩。由于重组蛋白含有6XHIS标签,浓缩液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱,亲和层析纯化重组酶,咪唑梯度竞争洗脱,纯化过程参照HIS纯化Kit说明书。纯化后的琼胶酶利用BCA法测定蛋白浓度,通过用12% SDS-PAGE检测酶液的纯度及分子量 (图4),在分子量大小为5;3KDa处有单一条带,和推测分子量大小相符,纯化蛋白达到电泳纯。纯化的重组β-琼胶酶Agafe保存于-40°C以备用。实施例5 利用重组β -琼胶酶AgaXa制备不同聚合度的新琼寡糖。将琼脂糖溶于lOmmol/L Tris-HCl(pH7. 4)缓冲液中,配成3%的琼脂糖溶液,冷却至45°C ;按lU/mL加入由实施例4得到的重组β -琼胶酶AgaXa ;在45°C条件下反应2- 小时既可以得到聚合度为6-14的新琼寡糖。1个酶活力单位(U)定义为每分钟产生Iymol还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。实施例6 利用重组β -琼胶酶AgaXa从琼脂糖凝胶中纯化DNA 从琼脂糖凝胶中纯化DNA的步骤如下。1. PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶中进行电泳。2.将含有目的片段的凝胶从切胶后加入已经称重的EP管中确认凝胶的重量。3.按 IOOmg 凝胶加入 200 μ L 的 IOmM Tris-HCl04.琼脂糖在65 °C下温浴至溶化,冷却至52 °C。5.按IOOmg凝胶加入0. 5U的重组琼胶酶AgaXa,同时加入终浓度为10 mM的DDT, 在52°C下酶切40min。6.冰浴IOmin后,12000r/min离心lOmin,取上清液加入DNA硅胶模结合液。7.步骤6所得的混合液加入具有硅胶膜的DNA纯化柱中,12000r/min离心lmin。8.加入75%的乙醇12000r/min离心Imin洗柱,重复一次;12000r/min离心3min 除去残余的乙醇。9.加入30 μ LTE缓冲液,12000r/min离心lmin,收集洗脱液,即得到纯化的DNA片段。
权利要求
1.一种β-琼胶酶基因agaXa,其特征在于编码了 feimira^/ sp. X3的一个琼胶酶 AgaXa,并且具有以下核苷酸序列:ATGAAACTATTGAATAAGTTTTCTCGTGCTCAGCTTTTCGGATTACT CGCGGGCGTATGTTGTTCAACCACAGCCGTTCAAGCAGCAACTTTTACCGTATACAACGAAACCCAATTAAATAACG CATTAACTTCTGCGCAAAATAATGGCCTAGATACTTTAGATACAATAAAGATCAGCGGTACTATTAACATTTACGGA CAAATAGATATTAAGTCATCTGTAAAAATTACTGGTGCTCAAACAAACAGAGCGTCAAAATTAACTAGACGCAACAC AGGCTTTTACAACCCGCTCATTAACGTACAATACAAAAACGTAACGGTTGAAAATATTACGCTTGAAGGTATTGGTG CGAACACTAATCAGCAATTATTATCTTTAGCTGGTGATGATACCAGCAACAGTGCATTGATTAACTTACCCGCAACT GCTTATGCTACTAACCCGAAAGGTTTTACTGCAACAAATGTTAACTTTTTTGATAGTGCAATAGGTGTTGCATCTGT AGGCATATTGCCACAAGACTTAAACGTTTCTTACAATACTTTTAGAAATATTAACCGTGCAGTGGAGCTTTTACGTG ACGTTGACCGTGTAGATGATGCACTTTTAAATAACGCTCAAATTAAAGTAAACGGCAATATTATTGGTTTGTATGGC GGGAAGTTAAATATTTCAAATAACTTAATTAACGCTGAAAACATGCGTTTGGCGATATCTTTAGACGGCGGCAACGA TGGTGCTGGTTTTATTGGCTCAGGCTTTTTAAACCCTTGGTCTGAAAAACGCCAAACCTATACCGACAAGCCCGTTT ATTATTCAAGCGTAATTGGTGAAGCGGTTATCAATAACAACCGTATTGGTTATTATCAACACACAGACGGCGCAGTA TGGACTGTTGGTCAAACTCGTGAATTTGGTATCGCACTTGCAACAGTTGCGAATATTTATGTAGTCGGTAACCATGT AAGAACTGGTTTAAACTTTGTAACGCAAGGTGACGGTGTCACGCCAGTAAACAATGCAAGTTTCGGCTTTGGCTCTG CAATTAATGTTGAACACAATGGCGAAAACATTGTAATTCAAAGCAACCATATTCATGTTGGTGCAAAAGGCAATGGT GCAAATGCTTTTACTATTTTGGCGTTTAACGACCACGGCGCATATTGGAATTTAGCTCAAACCTCTAAAAACCTAAC ATATGCAAACAACGTGATTAGTGGCAGTGGTGCAAATGTGTTTTATGCGATTGGCTACAGAAACTTAAACATGCTTA ATAACGATGTACGTAACTTTAGCTCAAGTGGTGCAGTATTCGGCTGTGGTGGTGTGGTATCCCCTATCAATAACTTT TTAGCGAATGTCCCTGGTGGTTATAGCAATAGCTATATTGAACAAAACCCAGCTACCCATGGTCGTTTATGGTTTGA TGCTGTGCGAAATAATGGCCAAGTAGTCGGCGCATTTACCGGTCAAGGTTCAAGAGCGCCACGCTCGTTTTATTACT TGTCAGGAGACGATCCGAAAAATCCAAGATTTGGCGATGCCCAAGTAGTGGATTCAGTCAGTATTATGGGTTGTAAT TAA。
2.大肠杆菌克隆载体pBSK-agaXa,其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaXa。
3.大肠杆菌重组菌DH5α -pBSK-agaXa,其含有权利要求2所述的大肠杆菌克隆载体。
4.大肠杆菌表达载体pET32-agaXa,其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaXa。
5.大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa,其含有权利要求4所述的大肠杆菌表达载体。
6.重组β-琼胶酶AgaXa,其由权利要求5所述的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-agaXa 发酵生产。
7.权利要求6所述的重组β-琼胶酶在从琼脂糖凝胶中回收DNA的应用。
8.权利要求6所述的重组β-琼胶酶在降解琼脂糖制备新琼寡糖中的应用。
全文摘要
一种β-琼胶酶AgaXa,是由Catenivulumsp.X3的一个琼胶酶基因agaXa编码的一种新型琼胶酶。本发明的β-琼胶酶AgaXa及独特之处是在47℃(琼脂糖凝固的温度为40℃)时,酶活性稳定且酶活力高,因此本发明可以应用于从琼脂糖凝胶中回收DNA,且具有优势。本发明β-琼胶酶AgaXa能够特异的降解琼脂糖产生聚合度为6-14的新琼寡糖,能够应用于生产多聚寡糖。本发明的大肠杆菌重组菌株BL21-pET32-agaXa能够大量的表达β-琼胶酶AgaXa,易于纯化,可应用于生产β-琼胶酶AgaXa,且成本低。
文档编号C12R1/19GK102399802SQ20111012897
公开日2012年4月4日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者周峥嵘, 李升康, 林伯坤, 胡忠, 谢伟 申请人:汕头大学
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