专利名称：：一种根结线虫生防微生物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种根结线虫的生防微生物及其应用，属微生物农药
技术领域：
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背景技术：
：根结线虫(Meloidogynesw.)是分布最广、为害最重的植物寄生线虫，由根结线虫在全世界农作物上造成的损失高达1000亿美元(OkaY,KoltaiH,Bar-EyalΜ,etal.2000.Newstrategiesforthecontrolofplant-parasiticnematodes.PestManag.Sci,56，983-988.)。根结线虫的主要种类有南方根结线虫CKi/⑶卵iia)、花生根结线虫CMarmaria)、爪哇根结线虫CK及北方根结线虫CMAa/^a)。烟草根结线虫病在我国烟区普遍发生，危害日趋严重，仅云南省发病面积高达40余万亩，造成烟叶减产30%-50%，已成为烟叶生产中的主要病害之一(祝明亮，雷丽萍.2008.烟草微生物学.科学技术出版社，北京，P1-384.)。长期以来，对根结线虫病的防治主要依赖于化学防治，用吠喃丹、克线丹等剧毒或高残留的化学杀线虫剂，由于多年使用，已产生抗药性，防治效果逐年下降，而且常造成严重的环境污染、农田土壤质量退化等现象(AbawiGS,WidmerTL.2000.Impactofsoilhealthmanagementspracticesonsoilbornepathogens,nematodeandrootdiseasesofvegetablecrops.ApplSoilEcol,15⑴37-47)。由于化学杀线剂毒性强、残留高，对环境污染大，目前绝大多数化学杀线剂已被禁用。随着人类环保意识的增强，以及发展绿色烟叶、有机烟叶的需要，生物防治已经成为防控根结线虫的主导措施之ο目前，利用生防真菌开发线虫生物农药已有商业化产品，并在局部地区用于根结线虫的防治，如以厚垣轮枝霉(Verticilliumchlamydosporiuni)开发的我国第一个线虫生防商品制剂“线虫必克”，以淡紫拟青霉Bhci/ms)开发的系列产品。然而，目前这类以真菌为生防菌的线虫生防菌剂存在的最大问题是防效低且不稳定。主要原因是真菌生防菌在土壤中普遍受到土壤抑真菌作用(LockwoodJL.1977.Fungistasisinsoil.BiologicalReviews,52(1):1-36.)的影响，生防菌的萌发率很低，一般在0-30%之间，很少超过50%，很难在土壤中建立达到控制靶标对象所需的种群密度。这类生防菌在根际的定殖能力已经成为阻碍其产品大面积推广应用的瓶颈问题。植物内生菌(Plantendophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌(StoneJK，BaconCW.2000.Anoverviewofendophyticmicrobes:endo-phytismdefined.BaconCW,WhiteJFJr.MicrobialEndophytes.NewYork:MarcelDekkerjP3-9)。植物内生细菌易于定殖在植物体内，相对于植物外生生防微生物，在定殖方面更具优势。
发明内容3本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种根结线虫的生防微生物及其应用方法。杀线虫鞘氨醇杆菌QSphingobacteriumnematocida)ZY-71-1菌株系本专利申请人从烟草红花大金元品种新鲜叶片中分离、鉴定的一种植物内生细菌新物种。该微生物通过产生活性有机挥发物毒杀线虫，在烟草根际有很好的定殖能力，该种微生物对根结线虫的生防特性和效果未公开报道。本发明从烟草内生菌中筛选具有工业化生产前景的菌株，为烟草农业生产中根结线虫的防治提供一种具有较好防治效果的生防微生物。本发明的根结线虫生防微生物是杀线虫鞘氨醇杆菌iSphingobacteriimnematocida)ZY_71_1菌株，该菌株已于2011年1月14日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏号CGMCCNo.4553。SphingobacteriumnematocidaZY-71-1菌株在牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g,NaCl5g，琼脂20g，补水至1000ml,pH6.8)上，菌落呈黄色，圆形，表明湿润，边缘凸起，细胞为杆状，直径0.4-0.8μπι，*1.0-1.5μm，孢子不游动，革兰氏阴性。该菌株在10°C至40°C的温度范围内生长，最适生长温度37°C;在pH6.0到9.0的范围内可以生长，最适生长PH为7.0；可以在浓度为0-3%WNaCl(w/v)范围内生长，最适生长的NaCl浓度为0-1%。利用引物5，-GGTTACCTTGTTACGACTT_3，，5，_AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’经PCR扩展该菌株的16SrRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为JF731241，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。利用本发明的ZY-71-1菌株可用于制备防治烟草根结线虫病菌剂，该菌剂为可湿性粉剂，是通过以下方法制备的经培养获得的ZY-71-1菌体及其代谢物作为原药与适量的硅藻土、木钠、K12、蔗糖、海藻酸钠混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可湿性粉剂，菌剂需保证ZY-71-1的活菌数含量在1XIO9个/g以上。利用ZY-71-1菌株制备的可湿性粉剂对防治烟草根结线虫病有很好的防治效果。能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。施用时可将ZY-71-1菌剂与烟草育苗基质混合使用，也可在移栽时施入烟草根际周围，或在成熟期兑水灌根。对病害发生严重田块，移栽期和成熟期分别施用一次效果最好。^MSphingObacteriumnematocidaZY-71-1菌株制备的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治根结线虫病的高效生物农药。具体实施例方式1.本发明中ZY-71-1的培养及菌剂制备ZY-71-1菌株试管斜面种子培养将该菌株的菌体接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，15-40°C下培养1-5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是37°C下培养2天。ZY-71-1菌株液体种子的培养将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基不添加琼脂)中，15-40°C，50-350rpm条件下摇床培养2-7天。最适培养条件为37°C，200rpm条件下培养3d。ZY-71-1菌株在发酵罐中的大量培养将液体种子按1-5%(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在温度^-40°C，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2_3d。ZY-71-1菌株可湿性粉剂的制备经发酵罐培养获得的ZY-71-1菌体及其代谢物作为原药与适量的硅藻土、木钠、K12、蔗糖、海藻酸钠混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可湿性粉剂。菌剂需保证ZY-71-1的活菌数含量在IXIO9个/g以上。2.ZY-71-1菌株发酵液对烟草根结线虫幼虫和卵的毒杀活性在三分隔塑料培养皿内，其中一隔加入按上述方法制备的ZY-71-1菌株液体种子发酵液3ml；其它两分隔内倒入水琼脂培养基(琼脂20g，水1000ml)，冷却后在培养基表面上分别加入烟草根结线虫二龄幼虫约500条，卵约300粒，培养皿用封口膜封边。用等体积的无菌水替代ZY-71-1菌株发酵液做对照。在下放置24h后，统计幼虫死亡数并计算死亡率；放置7d后统计卵的孵化率。幼虫死亡率=死亡线虫数+计数线虫数X100%校正死亡率=处理死亡率-对照死亡率孵化率=孵化卵数+计数卵数X100%校正孵化率=对照孵化率-处理孵化率平板测定结果表明，ZY-71-1菌株是通过产生活性挥发性有机物毒杀线虫。在ZY-71-1发酵液处理中，烟草根结线虫二龄幼虫的死亡率为100%，扣除对照中3.5%的幼虫死亡率，ZY-71-1对烟草根结线虫二龄幼虫的致死率高达96.5%。在ZY-71-1发酵液处理中，烟草根结线虫卵的孵化率为0，对照中卵的孵化率为94.5%，ZY-71-1对烟草根结线虫卵的致死率高达94.5%ο3.ZY-71-1菌株可湿性粉剂防治烟草根结线虫病的温室试验供试菌剂活菌数为1XIO9个/g的ZY-71-1可湿性粉剂。烟草品种红花大金元。供试线虫花生根结线虫(Iarenaria).试验方法烤烟漂浮育苗时，取20gZY-71-1可湿性粉剂用300ml自来水稀释后与Ikg烟用育基质混勻后装入育苗盘并播入烟草种子，其余操作和管理按烤烟常规漂浮育苗方法进行。待烟苗长至5-6片叶时，在直径为15cm的花钵内装入250g沙土，250g腐殖土，5g菌剂，混勻后每一花钵移栽一株烟苗，并在烟根附近接入约2000条花生根结线虫二龄幼虫。移栽30d后每烟株用5g菌剂兑水IOOml灌根。空白对照用等体积的自来水替代菌剂，每处理五盆、三个重复。肥水管理按常规方法进行。移栽后在20-28°C的温室内生长90天时统计各处理的发病率和根结指数。发病率=发病株数/调查株数X100%根结指数=[Σ(各级植株数X级值)]+(调查总株数Χ4)X100(方仲达.2007.植病研究方法，第三版.中国农业出版社，pp.324-325)试验结果空白对照的发病率为10096，根结指数为91.67。ZY-71-1可湿性粉剂处理的发病率为17.3%，根结指数为21.34，与对照比较，发病率下降82.7%，根结指数下降70.33，显示出ZY-71-1对烟草根结线虫病良好的防治效果。权利要求1.一种根结线虫生防微生物，其特征在于所用的生防微生物为杀线虫鞘氨醇杆菌(.Sphingobacteriumnematocida)Ti-l\-\菌株，该菌株2011年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCCNo.4553。2.一种如权利要求1所述的根结线虫生防微生物的应用，其特征在于所述ZY-71-1菌株作为制备防治烟草根结线虫病菌剂的应用。3.根据权利要求2所述根结线虫生防微生物的应用，其特征在于防治烟草根结线虫病菌剂为可湿性粉剂，是通过以下方法制备的经培养获得的ZY-71-1菌体及其代谢物作为原药与硅藻土、木钠、K12、蔗糖、海藻酸钠混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可湿性粉剂，菌剂需保证ZY-71-1的活菌数含量在IXIO9个/g以上。全文摘要本发明涉及一种根结线虫生防微生物及其应用，属于微生物农药
技术领域：
。本发明的微生物为杀线虫鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumnematocida)ZY-71-1菌株，于2011年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.4553。ZY-71-1菌株的16SrRNA基因序列(此序列在GeneBank数据库中的序列号为JF731241)是鉴别该菌株的主要特征依据。本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂制成ZY-71-1可湿性粉剂生防菌剂。该菌剂对烟草根结线虫病有很好的防治效果。本发明的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是控制根结线虫病的高效生物农药。文档编号C12N1/20GK102212498SQ20111013723公开日2011年10月12日申请日期2011年5月26日优先权日2011年5月26日发明者周汉平,奚家勤,宋纪真,尹启生,张仕祥,王广山,王建伟,薛超群申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院