专利名称：用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、pcr引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种用于医学上用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，本发明还涉及一种用于扩增待检样品基因片段的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，缩略词为PCR)引物；本发明还涉及一种用于诊断非综合征耳聋的试剂盒。
背景技术：
耳聋是一种最常见的人类感觉系统缺陷，因其病因复杂、发生率高和治疗困难等原因而长久地困扰着广大患者及其周围人群，极大地影响着相互交流和生活质量。重度耳聋在新生儿中发生率高达l/80(Tl/1000，全世界将近有七千万人罹患55分贝以上的听力减退。造成耳聋有多方面的原因，遗传因素是主要原因。耳聋可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。也可由环境因素、或基因与环境两者共同作用而致。耳聋可分综合征型和非综合征型，伴随有其他组织器官的病变的耳聋属于综合征型听力缺损 (syndromic hearing impairment, SHI)，不伴有其他症状的耳聋属于非综合征型听力缺损 (nonyndromic hearing impairment，NSHI)。而70 %的遗传性耳聋表现为非综合征耳聋 (即除耳聋外不伴有其他症状和体征)。至2011年1月1日止，与非综合征耳聋相关的25 个常染色体隐性基因、36个常染色体显性基因、2个X连锁基因已被克隆，而每个基因中又散在数目众多的耳聋突变位点，因而具有较高的基因和位点遗传异质性。最近，在国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，相当一部分非综合征耳聋仅由为数不多的几个基因突变引起，如GJB2、SLC26A4，mtDNA 12s rRNA及GJB3等，这为我们大规模开展耳聋基因筛查及诊断提供了理论依据。目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)，直接测序等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。而基因芯片法虽然能同时对不同基因位点进行检测，但它所需设备和耗材昂贵，不适用于在临床大规模推广，应用受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补上述现有技术的不足，提出一种用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条、一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，以及一种用于诊断非综合征耳聋的试剂盒；本发明具有高通量、高效率、价格低廉、使用方便等优点，有利于实现临床快速检测和大规模人群筛查。本发明的一种用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条采用以下的技术方案
所述用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，其特征在于包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个非综合征耳聋的基因突变位点，所述非综合征耳聋的基因突变位点为以下位点中的至少一个GJB2基因的CDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA^9-300 位点，GJB3 基因的 CDNA538 位点，mtDNA 12s rRNA 基因的cDNA1555、cDNA1494位点，SLC26A4基因的cDNA2168、IVS7-2位点；每一条所述突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的非综合征耳聋基因的突变碱基。优选的，所述突变检测探针为SEQ ID NO. Γ SEQ ID NO. 9中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。优选的，所述基底上还固定有正常对照探针，其与所述突变检测探针固定在所述基底的不同位置上。优选的，所述正常对照探针为SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 18中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。优选的，每一个所述正常对照探针都对应包含一个所述非综合征耳聋的基因突变位点，其中，SEQ ID NO. 10对应的基因突变位点为CDNA35，SEQ ID NO. 11对应的基因突变位点为cDNA176-191，SEQ ID NO. 12对应的基因突变位点为cDNA235，SEQ ID NO. 13对应的基因突变位点为cDNA^9-300位点，SEQ ID N0. 14对应的基因突变位点为cDNA538，SEQ ID NO. 15对应的基因突变位点为cDNA1494，SEQ ID N0. 16对应的基因突变位点为cDNA1555， SEQ ID NO. 17对应的基因突变位点为cDNA2168，SEQ ID N0. 18对应的基因突变位点为 IVS7-2。优选的，所述突变检测探针和/或正常对照探针的3’或5’端带有氨基标记。本发明的一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物采用以下的技术方案 所述用于扩增待检样品基因片段的PCR引物扩增权利要求1所述的基因突变位点，所
述PCR引物为以下5对中的至少一对SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 20 ；SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 22 ； SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 ； SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 ； SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 ；其中 SEQ ID N0. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27是上游引物；SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28是下游引物。优选的，所述的扩增产物分别包括如下位点引物SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 20 扩增 GJB2 基因的 cDNA35、cDNA176_191、cDNA235、cDNA299_300 位点，引物 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 扩增 GJB3 基因的 cDNA538 位点，引物 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID NO. M 扩增 mtDNA 12S rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位点，引物 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 扩增 SL(^6A4 基因的 cDNA2168 位点，引物 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 扩增 SL(^6A4 基因的IVS7-2位点。优选的，所述上游引物和/或下游引物的5’端带有生物素或荧光标记。本发明的一种用于诊断非综合征耳聋的试剂盒采用以下的技术方案
所述用于诊断非综合征耳聋的试剂盒，包含上述的用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，以及含有上述用于扩增待检样品基因片段的PCR引物的PCR反应液。本发明与现有技术对比的有益效果是本发明是基于PCR-膜条杂交技术的基因检测方法，由于固定在基底上的突变检测探针的大致中间位置包含有非综合征耳聋的基因突变位点，通过PCR加膜条杂交技术能直接对待检者的基因型进行确诊，对正常、突变杂合子、突变纯合子等很容易判断，具有高通量、高效率、价格低廉、使用方便等优点。
图1是本发明实施例的未检出非综合征耳聋基因突变样品结果示例，其基因型为N/N ；
图2是本发明实施例的非综合征耳聋基因突变杂合子样品结果示例，其基因型为 35M/N ；
图3是本发明实施例的非综合征耳聋基因突变纯合子样品结果示例，其基因型为 35M/35M ；
图4是本发明实施例的非综合征耳聋基因双重突变杂合子样品结果示例，其基因型为;35M/235M。
具体实施例方式下面对照附图和结合优选具体实施方式
对本发明进行详细的阐述。1、杂交膜条的制备
1. 1、9条突变检测探针和9条正常对照探针的制备
按照表1和表2中的序列合成18条探针，突变检测探针和/或正常对照探针的3’或 5’端带氨基标记，合成的方法为现有的常规的DNA合成法。表1
权利要求
1.一种用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，其特征在于包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个非综合征耳聋的基因突变位点，所述非综合征耳聋的基因突变位点为以下位点中的至少一个GJB2基因的 cDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA299-300 位点，GJB3 基因的 cDNA538 位点，mtDNA 12s rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位点，SL(^6A4 基因的 cDNA2168、IVS7-2 位点；每一条所述突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的非综合征耳聋基因的突变碱基。
2.根据权利要求1所述的杂交膜条，其特征在于所述突变检测探针为SEQID NO. Γ SEQ ID NO. 9中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。
3.根据权利要求1或2所述的杂交膜条，其特征在于所述基底上还固定有正常对照探针，其与所述突变检测探针固定在所述基底的不同位置上。
4.根据权利要求3所述的杂交膜条，其特征在于所述正常对照探针为SEQID NO. 1(Γ SEQ ID NO. 18中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。
5.根据权利要求4所述的杂交膜条，其特征在于每一个所述正常对照探针都对应包含一个所述非综合征耳聋的基因突变位点，其中，SEQ ID NO. 10对应的基因突变位点为 cDNA35, SEQ ID NO. 11对应的基因突变位点为cDNA176_191，SEQ ID NO. 12对应的基因突变位点为cDNA235，SEQ ID NO. 13对应的基因突变位点为cDNA^9_300位点，SEQ ID NO. 14 对应的基因突变位点为cDNA538，SEQ ID NO. 15对应的基因突变位点为cDNA1494，SEQ ID NO. 16对应的基因突变位点为cDNA1555，SEQ ID NO. 17对应的基因突变位点为cDNA2168， SEQ ID NO. 18对应的基因突变位点为IVS7-2。
6.根据权利要求5所述的杂交膜条，其特征在于所述突变检测探针和/或正常对照探针的3’或5’端带有氨基标记。
7.一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，其特征在于所述PCR引物扩增权利要求1所述的基因突变位点，所述PCR引物为以下5对中的至少一对SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20 ； SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 ； SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 ； SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26 ；SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28 ；其中 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27是上游引物；SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28 是下游引物。
8.根据权利要求7所述的PCR引物，其特征在于所述的扩增产物分别包括如下位点 引物 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20 扩增 GJB2 基因的 cDNA35、cDNA176_191、cDNA235、 cDNA299-300 位点，引物 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 扩增 GJB3 基因的 cDNA538 位点， 引物 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 扩增 mtDNA 12S rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位点，引物 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 扩增 SLC26A4 基因的 cDNA2168 位点，引物 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 扩增 SLC26A4 基因的 IVS7-2 位点。
9.根据权利要求7或8所述的PCR引物，其特征在于所述上游引物和/或下游引物的5’端带有生物素或荧光标记。
10.一种用于诊断非综合征耳聋的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，以及含有权利要求7所述的用于扩增待检样品基因片段的 PCR引物的PCR反应液。
全文摘要
本发明公开了一种用于诊断非综合征耳聋的杂交膜条，包括基底，以及固定在基底上的突变检测探针，每一条突变检测探针分别对应包含一个非综合征耳聋的基因突变位点，基因突变位点为以下的至少一个GJB2基因的cDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA299-300位点，GJB3基因的cDNA538位点，mtDNA12srRNA基因的cDNA1555、cDNA1494位点，SLC26A4基因的cDNA2168、IVS7-2位点；每一条突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在序列的中部位置包含其相对应的非综合征耳聋基因的突变碱基。本发明具有准确性高、价格低廉等优点。
文档编号C12Q1/68GK102220434SQ20111014046
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者危梅娟 申请人:危梅娟