专利名称：利用双质粒系统在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域中的重组蛋白质药物制备技术，具体涉及一种利用双质粒系统直接在大肠杆菌中表达生产具有溶栓活性的药物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。
背景技术：
由心血管疾病引发的血栓并发症严重威胁人类生命，是造成死亡和病残的主要原因之一。全世界每年心血管疾病患者多达1300万，其中急性心肌梗死(AMI)死亡率高达30%，因此研制、发展高效、特异、安全、副作用小的溶血栓药物，一直是世界范围的热门课题。rPA是分子量为39. 6 kD的单链蛋白，由355个氨基酸组成，是人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(Tissue type plasminogen activator，tPA)缺失4-175位氨基酸序列的缺失变体。rPA —级结构中不含tPA分子中的Kringle 1、Finger、EGF结构域，但保留了 Kringle 2及丝氨酸蛋白酶结构域。与tPA相比，rPA具有溶栓速度快、半衰期长、再通率高和副作用小等优点，是目前临床上应用最好的第三代溶栓药物之一。目前，国内外采用基因工程方法生产rPA的研究主要是应用酵母及哺乳动物细胞等真核表达系统中，成本较高，生产周期长，产率很低，且真核细胞内表达产物易产生糖基化而影响生物活性。大肠杆菌等原核表达系统是目前最为成熟的基因工程表达体系，具有生产成本低，产率高等优点，然而尽管也有不少学者尝试在大肠杆菌系统中表达rPA基因， 但由于rPA富含9对二硫键，大肠杆菌系统很难直接形成正确的空间构象，致使表达产物多以包涵体蛋白形式存在，必须将细胞破碎后才能将其分离出来，分离过程中要用蛋白质变性剂，最后还要再把蛋白质复性，在复性过程中还会产生许多结构异常的分子，工艺复杂， 收率较低，成本较高，而且容易影响产品的质量，从而影响到药物的疗效。中国专利CN200710303763. 3公开了一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法。它所提供的在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法是将瑞替普酶基因插入到表达载体PRSETa的多克隆位点，得到重组表达载体，再将该重组表达载体与质粒PREP4共转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到瑞替普酶。但该方法中存在一些问题 PRSETa与pREP4质粒均缺乏辅助二硫键形成的元件，利用pREP4质粒所表达的LacI虽然可以激活pRSETa-rPA质粒中rPA的高效表达，但却无法辅助形成rPA活性所必需的二硫键， 因此该专利对所获得的rPA重组蛋白质仅通过western blot进行鉴定，未能就其溶栓活性加以验证，无法确保实现正确的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用双质粒系统，直接在大肠杆菌中表达制备具有活性的溶栓药物瑞替普酶(rPA)的方法。本发明是将rPA基因插入到原核表达载体pET22b的多克隆位点，得到重组表达质粒pET22b-rPA，再将该重组表达质粒与表达质粒pET40b共转化大肠杆菌，得到同时含有这两种质粒的重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，诱导表达后得到rPA。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案
一种利用双质粒系统在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下步骤
(1)将rPA编码基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，使其位于pelB信号肽下游，构建得到pET22b-rPA重组质粒；
(2)将pET22b-rPA、pET40b两种质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)，在Amp和Kan双抗选择压力下，筛选得到同时含有pET22b-rPA、pET40b两种质粒的大肠杆菌；
(3)培养该重组大肠杆菌，用IPTG进行诱导表达；
(4)收集菌液，超声破碎离心后，分别对上清及沉淀进行SDS-PAGE检测；
(5)用纤维蛋白平板法检测确定表达产物的溶栓活性。本发明所述的方法，其中步骤(1)中rPA基因片段插入表达载体pET22b中，置于 pelB信号肽下游，pelB信号肽能够协助目的蛋白rPA转运到细胞周质，有利于蛋白质形成正确的二硫键及空间折叠。本发明所述的方法，其中所述基因工程菌需要将pET22b-rPA和pET40b质粒共转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，其中pET40b可表达二硫键异构酶DsbC并定位到细胞周质， 并催化rPA的二硫键形成，使其直接以有活性的可溶形式表达，无需进行包涵体复性。本发明所述的方法，其中rPA编码的基因序列如序列表NOl所示。本发明所述的方法，其中重组大肠杆菌pET22b_rPA的氨基酸序列如序列表N02所
7J\ ο本发明所述的方法，其中所述的rPA编码基因克隆插入pET22b载体所用PCR引物序列为
上游引物5，-CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' N03 ； 下游引物5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ N04 ； 其中在上下游引物中分别引入了 I和历^dIII酶切位点(下划线部分)。本发明所述的方法，其中步骤(2)中利用Amp和Kan两种不同抗生素的选择压力， 筛选同时含有两种质粒的重组菌。因为在筛选培养基中同时存在两种抗生素，缺乏其中任何一种质粒的细菌都会因为失去该质粒所携带的抗性而被相应的抗生素所杀死，因此在存活下来的细菌中将同时含有两种质粒，并能够同时表达这两种质粒所携带的基因，其中 pET22b-rPA可表达rPA并利用pelB信号肽将其引导到细胞周质空间，pET40b可表达DsbC 并同样定位到细胞周质空间，同时DsbC可催化rPA 二硫键的正确形成。本发明所述的方法，其中所述的培养该重组大肠杆菌的过程中需加入终浓度为 0. 6 mM 的 IPTG 于 25°C诱导 3 h。本发明利用两种质粒pET22b_rPA与pET40b共转化大肠杆菌，得到了具有溶栓活性的目的蛋白rPA。本方法所获得的目的蛋白无需包涵体复性、无需切除融合蛋白标签等处理即可实现rPA重组蛋白的高效可溶性表达，生产工艺过程简单，成本低廉，为rPA的大规模生产奠定了坚实的基础。
图 1 是 pET22b-rPA 重组质粒构建的酶切验证；1 :lkb DNA ladder Marker ；2 pET22b质粒经汉警H I和历·Ζ7(1ΠΙ双酶切；3 :pET22b_rPA质粒经汉警H I和历idIII双酶切；
图2是IPTG诱导rPA在双质粒系统大肠杆菌中表达的SDS-PAGE检测；M 蛋白质 Marker ；1 共转pET22b_rPA和pET40b的大肠杆菌表达的包涵体形式的蛋白质；2 共转 pET22b-rPA和p ET40b的大肠杆菌表达的可溶性蛋白质；3 共转pET22b_rPA和pET40b的大肠杆菌表达的总蛋白质；
图3是用IPTG诱导表达后的溶栓活性检测图；；1 :tPA标准品(1000 U/mL, 10 μ L)； 2 :PET22b-rPA转化的大肠杆菌的表达产物(30 μ L) ；3 :pET40b转化的大肠杆菌的表达产物(30 μ L) ；4 共转pET22b-rPA和pET40b的大肠杆菌的表达产物(30 μ L)。
具体实施例方式为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。其中所用试剂均有市售。实施例1
rPA基因工程菌的构建
1、以本实验室前期研究中构建的pMD18T-tPA质粒作为模板(江洁，江成英，杜连祥等.Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达.华南理工大学学报自然科学版， 2006， 34(12) 25-29)。采用上游引物
5’ -CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' (N03)； 下游引物
5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ (N04)；
进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶纯化方法纯化回收获得rPA基因片段。为方便后续操作，在上下游引物中分别引入了I和历^dIII酶切位点(下划线部分)。经过序列比较证实PCR扩增得到的rPA编码基因序列与已知的rPA基因序列完全一致，具体序列如下所示(序列表N01)
TCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAG TCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCA GGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGA ACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAG GTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCC AGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAG AAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCA GCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGC AGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGA CAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGG GAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAG AAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTAA 2、将rPA基因和pET22b质粒(购买于Novagen公司)用Ba·和历/ dIII双酶切后，经 T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 α (天津科技大学工业微生物教育部重点实验室提供)，在含有100 μ g/mL氨苄青霉素(购自上海生工生物工程有限公司)的LB培养基平板上，培养12 h后挑取单克隆，提取质粒用BmMl和Η η III双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测有1.1 kb rPA目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pET22b-rPA (图1)。所表汰的重组蛋白质序列如下(序列表N02,其中,錄体激分为DelB信号肽，下划线部分为rPA 氨基酸序列。)
#mZ/ r^gZZZZ^6'/^i^MDIGINSDPSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPffNSMILIGKV YTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPD⑶AKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQ AAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCffILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDT YDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDffTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQ HLLNRTVTDNMLCA⑶TRSGGPQANLHDACQ⑶SGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWI RDNMRP
3、采用氯化钙转化法，将pET22b-rPA与pET40b等量共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用含100 μ g/mL Amp和50 μ g/mL Kan (购自上海生工生物工程有限公司)的 LB固体培养基筛选获得同时含有pET22b-rPA与pET40b两种质粒的重组大肠杆菌。实验同时分别转化pET22b-rPA、pET40b (购买于Novagen公司)单一质粒作为对照。4、实验结果表明成功构建了双质粒系统表达rPA的基因工程菌。实施例2
rPA在大肠杆菌中的诱导表达
1、将共转pET22b-rPA与pET40b质粒的重组大肠杆菌接种到5 mL含有终浓度50 μ g/mL Amp和30 μ g/mL Kan的LB液体培养基中，37 °C，220 rpm培养过夜。2、将上一步骤中所得过夜培养物分别按的体积比转接到200 mL的LB液体培养基中，培养至其0D600为0. 6时加入IPTG (终浓度0. 6 mM)于25°C进行诱导表达3 h03、诱导表达结束后，取3 mL菌液12000 rpm离心后收集菌体，加入SDS上样缓冲液，煮沸收集总蛋白质。剩余菌液12000 rpm离心收集菌体后采用超声法破碎后于12000 rpm离心后，分别对上清(可溶性蛋白质)及沉淀(包涵体形式蛋白质)进行SDS-PAGE检测， 见图2。4、实验结果表明在双质粒大肠杆菌系统中，rPA主要以可溶性两种形式进行表达。实施例3
重组蛋白质溶栓活性检测
1、制备纤维蛋白平板称取0.02 g纤维蛋白原加到装有5 mL PBS的小锥形瓶中，混勻后置于37°C预热10 min使其溶解。同时另取适量凝血酶放入装有ImL PBS的EP管，轻吹一下，放入37°C预热。2、称取0. 07 g琼脂糖用7 mL PBS溶解，加热使溶解后，冷却至适宜温度。将凝血酶溶液迅速混入纤维蛋白原的溶液中，立即混勻后加入至琼脂糖溶液中摇勻后，将混合液倒入平板中使其 冷却固化。3、用打孔器在事先准备好的纤维蛋白平板上打孔，加入30 111^待测样品，371下孵育12 h，检测溶栓圈大小。实验同时检测pET22b、pET40b单独转化大肠杆菌的诱导表达产物作为阴性对照，检测人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂tPA(中国药品生物制品检定所提供)标准品作为阳性对照。4、实验结果表明利用共转两种不相容质粒所获得的可溶性rPA目的蛋白具有显著的溶栓活性，而用pET22b、pET40b单独转化大肠杆菌的诱导表达产物则不具有活性。具体见图3。
权利要求
1.一种利用双质粒系统在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将rPA编码基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，使其位于pelB信号肽下游，构建得到pET22b-rPA重组质粒；(2)将pET22b-rPA、pET40b两种质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)，在Amp和Kan双抗选择压力下，筛选得到同时含有pET22b-rPA、pET40b两种质粒的大肠杆菌； (3)培养该重组大肠杆菌，用IPTG进行诱导表达；(4)收集菌液，超声破碎离心后，分别对上清及沉淀进行SDS-PAGE检测；(5)用纤维蛋白平板法检测确定表达产物的溶栓活性。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中rPA基因片段插入表达载体pET22b中，置于pelB信号肽下游，pelB信号肽能够协助目的蛋白rPA转运到细胞周质，有利于蛋白质形成正确的二硫键及空间折叠。
3.权利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌需要将pET22b-rPA和pET40b质粒共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，其中pET40b可表达二硫键异构酶DsbC并定位到细胞周质， 并催化rPA的二硫键形成，使其直接以有活性的可溶形式表达，无需进行包涵体复性。
4.权利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌的构建需要在Amp和Kan双抗选择压力下筛选获得。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的利用该重组大肠杆菌表达rPA的过程中需加入终浓度为0. 6 mM的IPTG于25°C诱导3 h。
6.权利要求1所述的方法，其中rPA编码的基因序列如序列表NOl所示。
7.权利要求1所述的方法，其中重组大肠杆菌pET22b-rPA的氨基酸序列如序列表N02 所示。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的rPA编码基因克隆插入pET22b载体所用PCR弓丨物序列为上游引物5，-CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' N03 ； 下游引物5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ N04 其中在上下游引物中分别引入了 Β— I和Hind III酶切位点。
全文摘要
本发明涉及一种利用双质粒系统在大肠杆菌中表达溶栓药物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通过PCR扩增得到rPA的基因片断，将该基因片断克隆到载体pET22b中，构建获得重组质粒pET22b-rPA。利用pET22b-rPA和pET40b二者不同的抗性，将其共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)的双抗选择压力下，筛选获得工程菌。该工程菌经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达后，可生产获得可溶性的rPA目的蛋白，经纤维蛋白平板法检测，证明本方法所获得的rPA蛋白不需进行复性，即可具有显著的溶栓活性。
文档编号C12N1/21GK102250933SQ20111014090
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者倪萌, 张同存, 罗学刚 申请人:天津科技大学