专利名称：一株高效降解甲氧咪草烟的鲍曼不动杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株鲍曼不动杆菌。
背景技术：
甲氧咪草烟(Imazamox)是德国BASF公司(原美国氰胺公司)20世纪80年代初研制开发的咪唑啉酮类大豆田专用除草剂，它对一年生和多年生的禾本科、阔叶科、莎草科杂草及多种灌木和落叶树有活性。由于该产品比其他灭生性除草剂具有较长的持效期，可控制杂草4 6个月，故20世纪90年代初期在北美、欧洲、东南亚等国家已得到大面积推广使用，是目前国内外使用量较大的一种灭生性除草剂品种，但这类除草剂在土壤中残留时间较长，容易对后茬作物正常生长造成影响。目前国内外对甲氧咪草烟的研究报道主要集中在使用情况和药害方面，而关于降解菌株的筛选以及应用方面较少。
发明内容
本发明提供了一株鲍曼不动杆菌(AcinetcAacter baumannii)菌株，可高效降解甲氧咪草烟，为甲氧咪草烟除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基石出。本发明高效降解甲氧咪草烟菌株的鲍曼不动杆菌为鲍曼不动杆菌 IB5 (Acinetobacterbaumannii IB5)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年04月01 日，保藏编号为CGMCC No. 4728 ；本发明鲍曼不动杆菌IB5为革兰氏阴性菌，杆状，细胞大小为(0. 3μπι 0. 5μ )Χ(0. 8μπι 2. 2μ )，无鞭毛(如图1所示)，产生菌膜，在无机盐固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。本发明鲍曼不动杆菌ΙΒ5氧化酶反应呈阴性，接触酶反应呈阴性。鲍曼不动杆菌 ΙΒ5能够水解淀粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本发明鲍曼不动杆菌ΙΒ5 (Acinetobacter baumannii IB5)通过 16S rDNA序列比对分析，与不动杆菌属(Acinetobacter)的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的 16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定鲍曼不动杆菌IB5属于不动杆菌属(AcinetcAacter)，为鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)菌株。本发明鲍曼不动杆菌IB5可在添加了甲氧咪草烟的LB培养基和无机盐培养基上生长，培养基中甲氧咪草烟的最佳终浓度为800mg/L。鲍曼不动杆菌IB5的最适生长温度为 37°C，最适合生长环境的pH值为6 7。本发明鲍曼不动杆菌IB5能够高效降解甲氧咪草烟，鲍曼不动杆菌IB5在甲氧咪草烟浓度为800mg/L的无机盐培养基中，在37°C、pH值为7的条件下，培养48h，对甲氧咪草烟的降解率达到92. 46%。本发明鲍曼不动杆菌IB5对甲氧咪草烟残留具有修复作用。
本发明鲍曼不动杆菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)属于不动杆菌属 (AcinetcAacter)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年04月01日，保藏编号为 CGMCC No. 4728 ο
图1为本发明鲍曼不动杆菌ΙΒ5的电子显微镜照片；图2为通过鲍曼不动杆菌ΙΒ5 和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图；图3为具体实施方式
二中甲氧咪草烟浓度和鲍曼不动杆菌IB5的菌体数量随时间的变化关系曲线，-■-为鲍曼不动杆菌IB5菌体数量变化曲线，-▲-为甲氧咪草烟浓度的变化曲线。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式高效降解甲氧咪草烟菌株的鲍曼不动杆菌为鲍曼不动杆菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年 04月01日，保藏编号为CGMCC No. 47280本实施方式鲍曼不动杆菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)为革兰氏阴性菌， 杆状，细胞大小为(0. 3 μ m 0. 5 μ m) X (0. 8 μ m 2. 2 μ m)，无鞭毛，产生菌膜，在无机盐固
体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对鲍曼不动杆菌 IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)进行生理生化鉴定鲍曼不动杆菌IB5氧化酶反应呈阴性，接触酶反应呈阴性。鲍曼不动杆菌IB5能够水解淀粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本实施方式鲍曼不动杆菌IB5可在添加了甲氧咪草烟的LB培养基和无机盐培养基上生长，培养基中甲氧咪草烟的最佳终浓度为800mg/L。其中无机盐培养基(IOOOmL)由 1. Og 的 NaCl、l. Og 的 NH4NO3U. 5g 的 K2HP04、0. 5g 的 KH2P04、0. Ig 的 MgSO4 · 7H20 和余量的蒸馏水组成。无机盐培养基加热充分溶解后于121°C高压灭菌15min，冷却至50 60°C后向其中加入甲氧咪草烟至终浓度为500mg/L。本实施方式鲍曼不动杆菌IB5的最适生长温度为37°C，最适合生长环境的pH值为 6 7。
具体实施方式
二 本实施方式鲍曼不动杆菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5) 由中国黑龙江省讷河市受除草剂污染的土壤中筛选得到。筛选按以下步骤进行取黑龙江省讷河市长期施用甲氧咪草烟药害农田土壤5g于灭菌的广口瓶中，加入50mL的生理盐水， 振荡30s，用8层纱布过滤，取过滤液ImL加入到无机盐培养基中，于30°C、180r/min条件下培养7 10天，期间不断补充甲氧咪草烟，使甲氧咪草烟的浓度提高至800mg/L，得富集培养液；将无机盐固体培养基(IOOOmL无机盐固体培养基由1. Og的NaCl、l. Og的NH4NO3U. 5g 的K2HP04、0. 5g的KH2P04、0. Ig的MgSO4 · 7H20、20g的琼脂和余量的蒸馏水组成)灭菌后冷却到50 60°C，加入甲氧醚草烟使其终浓度至800mg/L，制作平板，取富集培养液IOOyL 均勻涂布在平板上，于30°C培养24h后挑取生长较好的菌落进行三区划线以获得纯培养上述优选菌株经初筛、复筛和纯化，即可得到鲍曼不动杆菌IB5。对筛选得到的鲍曼不动杆菌IB5进行分子鉴定，按以下步骤进行用热破壁法提取筛选得到的菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR 扩增，然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。鲍曼不动杆菌IB5的16S rDNA序列长度为1524bp，其序列提交至GenBank获得的登录号为FJ550344。测序结果通过在线分析与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件Mega4. 0的Neibour-Joining进行系统发育树的构建(如图2所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与不动杆菌属(AcinetcAacter)的鲍曼不动杆菌(AcinetcAacter baumannii)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为 99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定鲍曼不动杆菌IB5属于不动杆菌属(Acinetobacter)，为鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。对本实施方式鲍曼不动杆菌IB5降解甲氧咪草烟的降解率进行测定，具体方法如下将鲍曼不动杆菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草烟的无机盐培养基中，于37°C、 PH值为7. O的条件下培养，设置不接菌的无机盐培养基为对照，做三个重复，每隔3小时取待测样品l.OmL，按1 5的比例加入二氯甲烷，剧烈振荡5min，静置分层，取下层有机相， 于45°C旋转蒸发至二氯甲烷完全挥发；流动相定容后，取10μ L进样检测。检测条件检测波长252nm;色谱柱ODS C18规格4. 6nmX 150nm ；流动相色谱甲醇1.0%乙酸(7 3)； 流速1. OmL/min ；进样量10μ L。根据甲氧咪草烟标准品的标准曲线计算出待测样品中甲氧咪草烟的残留量，根据以下公式求出其降解率甲氧咪草烟降解率(％) = [1_(实测残留量/对照实测残留量)]X 100。在甲氧咪草烟浓度为800mg/L、37°C、pH = 7. 0的最适生长条件下，菌株生长状况良好。培养液中甲氧咪草烟浓度和鲍曼不动杆菌IB5的菌体数量随时间的变化关系曲线如图3所示，随着菌体数量的增加，培养液中的甲氧咪草烟残留量逐渐减少，培养48h以后培养液中的甲氧咪草烟含量从800mg/L降低到60. 32mg/L,降解效率达到92. 46%，说明鲍曼不动杆菌IB5对甲氧咪草烟具有较高的降解效率。利用敏感作物检测本实施方式鲍曼不动杆菌IB5对甲氧咪草烟残留的修复作用， 具体方法如下将鲍曼不动杆菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草烟的无机盐培养基(以甲氧咪草烟为唯一碳源)中，于37 °C、pH值为7. 0的条件下培养4 后，取发酵液经过0. 02 μ m 的细菌滤器过滤，分别取5mL无菌的发酵液加入带有双层滤纸的灭过菌的2个平皿中，分别均勻地加入50粒油菜种子和50粒谷子种子，作为实验组；分别取5mL未接鲍曼不动杆菌 IB5的含有800mg/L甲氧咪草烟的无机盐培养基，分别加入带有双层滤纸的灭过菌的2个平皿中，分别均勻地加入50粒油菜种子和50粒谷子种子，作为对照组1 ；将鲍曼不动杆菌IB5 接入不含有甲氧咪草烟的无机盐培养基中，于37°C、pH值为7. 0的条件下培养4 后，取发酵液经过0. 02 μ m的细菌滤器过滤，分别取5mL无菌的发酵液加入带有双层滤纸的灭过菌的2个平皿中，分别均勻地加入50粒油菜种子和50粒谷子种子，作为对照组2，每组处理重复3次。然后于25°C培养2 3天，培养要保持通风和适宜的湿度。观察种子发芽情况后统计种子的发芽率，比较甲氧咪草烟对种子发芽率的抑制情况，结果如表1所示。(对照组 1表示甲氧咪草烟未降解的条件下种子的发芽情况，对照组2中不加甲氧咪草烟，可以检测种子本身的发芽情况)表 权利要求
1. 一株高效降解甲氧咪草烟的鲍曼不动杆菌，其特征在于高效降解甲氧咪草烟菌株的鲍曼不动杆菌为鲍曼不动杆菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年04月01日，保藏编号为CGMCC No. 4728。
全文摘要
一株高效降解甲氧咪草烟的鲍曼不动杆菌，它涉及一株鲍曼不动杆菌。本发明提供了一株鲍曼不动杆菌菌株，可高效降解甲氧咪草烟，为甲氧咪草烟除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。本发明高效降解甲氧咪草烟菌株的鲍曼不动杆菌为鲍曼不动杆菌IB5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年04月01日，保藏编号为CGMCCNo.4728。本发明鲍曼不动杆菌IB5能够高效降解甲氧咪草烟。
文档编号C12N1/20GK102250789SQ20111014502
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者刘丽萍, 刘春光, 张爽, 杨峰山, 杨鑫, 黄英泽 申请人:黑龙江大学