专利名称：含有etr1基因的双元表达载体的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种含有etrl基因的双元表达载体的构建方法及其应用。
背景技术：
乙烯是高等植物中促进器官衰老和果实成熟的激素。ACC合成酶、ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键酶，ETR是信号传导途径的关键酶。根据同源依赖性基因沉默(HDGS)原理，导入正义基因和反义基因均可实现内源基因沉默。使用反义RNA技术，有效抑制乙烯生物合成和阻断其信号传导，从而延长切花植物的瓶插寿命。目前国外已从番茄、苹果、豌豆、桃、矮牵牛、香石竹、猕猴桃等植物中克隆到ACC氧化酶基因；澳大利亚的研究者将香石竹ACC氧化酶基因cDNA导入香石竹后，使香石竹花瓣衰老明显延迟；Satoh等 在菊花中转入mDG-ERSl (etrl - 4)基因(这是从菊花中克隆的编码乙烯受体蛋白的突变体)也成功获得了叶片黄化现象明显减少的植株。在国内，也有不少关于观赏植物中乙烯与花朵开放、衰老关系的报道，而鲜切花可方便的装饰各种环境，但鲜切花的瓶插寿命极短，一般只有几天，如果要保持较好的观赏效果，就要频繁的更换，这造成了极大的浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种含有etrl基因的双元表达载体的构建方法及其在延长鲜切花瓶插寿命中的应用，将含有etrl基因的双元表达载体导入鲜切花，转基因的切花获得对乙烯不敏感的性状，可有效控制切花的衰老，延长其瓶插寿命。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案
含有etrl基因的双元表达载体的构建方法扩增拟南芥突变体etrl基因并克隆至表达载体pEASY-Tl上获得pEASY-Tl-etrl质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etrl基因片段，用同样的双酶切体系对PFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etrl基因片段和骨架片段用T4 DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etrl双元表达载体。上述构建方法中，扩增拟南芥突变体etrl基因的正向引物为5’ - ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；扩增拟南芥etrl基因的反向引物为5’ - cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA-3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，cg、cg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA 是特异弓 I 物序列。前述含有etrl基因的双元表达载体的构建方法所述的拟南芥突变体etrl基因来自于编号为CS237的拟南芥突变体。本发明还提供了前述含有etrl基因的pFGC5941_etrl双元表达载体在延长鲜切花瓶插寿命中的应用。采用前述双元表达载体延长鲜切花瓶插寿命的方法用含有etrl基因的pFGC5941-etrl双元表达载体转化根癌农杆菌LAB4404感受态细胞，采用根癌农杆菌介导的植物转基因方法将Atetrl基因导入鲜切花植物基因组，转化成功后常规培养，即可。与现有技术相比，本发明成功的使用拟南芥CS237突变体，克隆显性突变基因etrl构建了双元表达载体，将该载体导入鲜切花后，能有效抑制乙烯信号传导途径中的下游基因表达，使转基因的鲜切花获得对乙烯不敏感的形状，可将鲜切花寿命延长5 10天。
图I是质粒pEASY-Tl-ertrl结构简 图2是质粒pFGC5941结构简图； 图3是质粒pFGC5941-etrl结构简图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
详细说明本发明的技术方案。I、克隆etrl基因
拟南芥etrl突变体编号为CS237，购自拟南芥生物资源中心(The ArabidopsisBiological Resource Center , ABRC),播种于营养钵中，置于温控培养箱中生长，当植物生长到7 11片真叶时，用于RNA的提取。I. I 总 RNA 提取
按TaKaRa的RNAiso Plus试剂盒说明进行以下操作
①称取100克新鲜植物材料，加入适量的RNAisoPlus试剂，室温静置5分钟；
②12000g、4°C离心5分钟，上清液转移至I.5ml离心管中；
③加入1/5RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟；
④12000g、4°C离心15分钟；
⑤将上清液转移至新的I.5ml离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10分钟；
⑧12000g、4°C离心10分钟；弃上清液，保留沉淀并加入Iml 75%的乙醇清洗沉淀；
⑦7500g、4°C离心5分钟；弃上清液，吹干乙醇，加入40 μ I O. 1%的DEPC水溶解，电泳检测结果显示28S和18S条带清晰，无降解，总RNA质量较好。1.2cDNA 模板合成
cDNA 合成米用反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, ReverTraAce- α -，[TOYOBO CO.，LTD]]，反转录体系及操作步骤如下
在一灭菌的O. 5ml PCR管中，冰上配制如下试剂依次加入总RNA 2. 5 μ I (约I μ g)、I μ I 的 Oligo (dt) 20、RNase free H2O 8· 5 μ 1，总体积 12 μ 1，置于 PCR 仪上 65°C下 5 分钟，取出后再加入下列成份4μ I的5XRT BufferU μ I的dNTPs (IOmM)、I μ L的RNaseinhibitor (IOU),最后加入I μ L的Rever Tra Ace,终体积20 μ L,充分混合后，短暂离心至管底，再在PCR仪上运行下面的程序30°C下10分钟，42°C下40分钟，99°C下5分钟。反应完成后置-20°C保存备用。2、扩增获得etrl基因
RT-PCR 扩增的正向引物序列为(etrlS) :5’ - ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’
，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；反向引物序列为(etrlA):5，- cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA_3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，eg、eg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA是特异引物序列，设计扩增的ertl基因片段约2300bp。在一灭菌的O. 5mL PCR管中，依次加入17. 25μ L无菌重蒸水、2· 5μ L的10 XPCR缓冲液、I. 6 μ L 的 dNTP (2. 5mM)、0· 5 μ L 的 etrlS 引物(终浓度 IOpmol)、O. 5 μ L 的 etrlA弓丨物(终浓度IOpmol)、I μ L的cDNA模板和O. 15 μ L Taq DNA聚合酶(5U/ μ L)，总体积25 μ L ；PCR反应条件为预变性94°C、5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次变性940C，保持30秒，退火58°C，保持60秒，延伸72°C，保持60秒；最后于72°C保持10分钟。 电泳检测显示，扩增的基因片段长度与预期相符。3、克隆
将etrl基因采用T/A克隆至表达载体pEASY-Tl上获得pEASY-Tl-etrl质粒。按pEASY-Tl Simple Cloning Kit (北京全式金生物技术有限公司)说明书进行以下操作在灭菌的O. 5mL PCR管中依次加入PCR产物4 μ L、1 μ L的pEASY- Tl SimpleCloning Vector，轻轻混合，室温反应15分钟，获得pEASY-Tl-ertrl质粒，其结构如图I所
/Jn ο4、酶切
在pEASY-Tl-ertrl质粒的ASCI和BamhI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etrl基因片段，用同样的双酶切体系对PFGC5941质粒(如图2所示)进行双酶切获得PFGC5941骨架片段。具体操作如下
4. I双酶切
选用NEB公司的限制性内切酶，在灭菌的O. 5mL PCR管中，依次加入5 μ L的IOXNEBBuffer 4、10 15 μ L(约 2 μ g)的质粒、O. 5 μ L 的 100XBSA、lyL 的 Asc I UuL的BamHI-HF,补灭菌双蒸水至总体积50 μ L,37°C温育至少I小时。分别对pEASY-Tl-ertrl质粒和pFGC5941质粒进行此酶切操作。4. 2片段回收
配制I. 5%琼脂糖凝胶，将经过双酶切的质粒进行电泳分离，在紫外灯下回收pEASY-etrl 上的 etrl 片段及 pFGC5941 骨架片段，按照 E. Z. N. A. TM Gel Extraction Kit的使用说明进行以下操作
①电子天平称量紫外灯下割下的含目标条带的凝胶重量；
②按照Iμ g凝胶加入I μ I的比例加入ΧΡ2液，60°c，水浴至凝胶完全溶解，其间振荡
2-3 次；
③将凝胶、XP2混合液加入HiBindDNA柱(每柱最多加入700 μ I混合液)，IOOOOg离心I分钟；
④弃废液，将HiBindDNA柱重新放回收集管；⑤向柱中加入300μ LXP2液，IOOOOg离心I分钟；
⑥弃废液，将HiBindDNA柱重新放回收集管；
⑦向柱中加入700μ L SPff液，IOOOOg离心I分钟，(重复一次)；
⑧弃废液，将HiBindDNA柱重新放回收集管，13000g离心2分钟；
⑨将HiBindDNA柱放入新的离心管，加入30 50 μ L Elution Buffer,室温静置I分钟，13000g离心I分钟，得到回收片段。5、连接
将回收的PFGC5941骨架片段和etrl基因片段，用T4 DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etrl双元表达载体。
按DNA Ligation Kit (TaKaRa，大连)说明进行以下操作在灭菌的O. 5mL PCR管中，分别加入2μ L的回收的etrl及3μ L pFGC5941骨架、5 μ L的Solution I (酶溶液)，总体积10 μ L，室温下放置3 h或4°C过夜，进行连接反应。为了获得大量的pEASY-Tl-ertrl质粒和pFGC5941-ertl质粒，可以对其进行转化、扩繁和提取回收，具体操作如下
6、转化、扩繁和质粒提取
6.I质粒转化感受态大肠杆菌
①在LB平板上涂布40μ I的Amp、40 μ I IPTG和40 μ L χ-gal后暗置半小时以上；
②取出超低温冻存的感受态大肠杆菌细胞，冰上放置冻融；
③将步骤5所得的连接产物10μ L加入至50 μ L已经冻融的感受态大肠杆菌细胞中，用移液枪轻轻吸打均匀，冰上放置30分钟；
④将离心管在42°C下水浴90秒，快速将离心管转移至冰上，冰浴I 2分钟；
⑤每管加840μ L液体LB培养基，在37°C摇床温和摇动I小时；
⑤5000g离心I分钟，弃800 μ I上清，用余下的100 μ L培养基重悬大肠杆菌细胞并均匀涂布于已经制备好的LB平板上；
⑦在37°C下倒置培养12 16小时后，可观察到蓝、白斑菌落，用灭菌的牙签，挑选白色的单菌落到含Amp的液体LB培养基中，在37°C摇床上培养8 12小时，进行扩繁。6. 2质粒提取
按照E. Z. N. A. TM Plasmid Mini Kit质粒小提试剂盒说明操作
①柱平衡步骤向吸附柱CB3中加入500μ L的BL平衡液，12000g离心lmin，倒掉收集管中的液体将吸附柱重新放回收集管中；
②将在I.5ml离心管中过夜培养的菌液，IOOOOg离心I分钟，弃上清；
③向留有菌体沉淀的离心管中加入250μ L Solution I重悬大肠杆菌细胞；
④接着加入250μ L Solution II，孵育2分钟(不能超过5分钟)，温和上下翻转，使菌体充分裂解；
⑤接着加入350yLSolution III,立即温和的上下翻转使之充分混勻,直至白色沉淀形成，13000g、室温下离心10分钟；
⑥小心吸取上清并加入到吸附柱中，10000g、室温下离心I分钟，弃废液；
⑦向吸附柱中加入500μ L的Buffer HB, 10000g、室温下离心I分钟，弃废液；
⑧向吸附柱中加入700μ L的DNA Washing Buffer (含乙醇)，10000g、室温下离心I分钟，弃废液，重复一次；
⑨空柱13000g、室温下离心2分钟，弃废液，将吸附柱放入新的I.5mL离心管中；
⑩在位于吸附柱中间部位的膜上滴加30 50μ L的Elution Buffer,室温孵育I 2分钟，13000g离心I分钟，将质粒溶液收集到离心管中，并将提取的质粒保存在一 20°C冰箱中。重组质粒pFGC5941-ertl如图3所示。重组质粒pFGC5941_etrl，含卡那霉素抗性基因，在T-DNA区域具有植物强启动子CamV和抗除草剂Basta的BAR基因，因此可利用卡那霉素筛选带有质粒pFGC5941_etrl的农杆菌、用Basta筛选转基因植物。用携带pFGC5941-etrl的根癌农杆菌转化鲜切花，由于外源基因etrl的过量表达，可使转基因植物获得对乙烯不敏感的性状，从而达到延长鲜切花瓶插寿命的效果。具体操作方法如下
7、重组质粒pFGC5941-etrl转化感受态根癌农杆菌LBA4404
①向冰浴保存的根癌农杆菌LAB4404感受态细胞中加约Iμ g重组质粒，轻轻混匀。
②冰水浴30min后用液氮冷激IOmin。③37 °C水浴热激5min，接着冰上放置3min。④加入800 μ I LB液体培养基，28°C，225rpm摇菌3小时，进行菌体复苏培养。 复苏结束后于5000印111室温离心11^11，吸去80(^1上清液，余下的用100 μ I LB
液体培养基重悬菌体。⑥涂布于LB+Kan (50mg/L) +Rif (50mg/L)固体平板上，28°C倒置培养2天左右。⑦挑取单菌落在LB+Kan (50mg/L)+Rif (50mg/L)液体培养基中，28°C，225rpm 摇菌24小时，备用。8、转基因鲜切花(以切花月季为例)
采用根癌农杆菌介导的植物转基因方法，将外源基因导入植物基因组，具体操作如
下
①采用叶片或茎段等作为外殖体，诱导植物愈伤组织，并作为外源基因的受体系统。②挑取带pFGC5941_etrl 的农杆菌单菌落,在 LB + Kan (50mg/L) + Rif (50mg/L)的液体培养基中，250 rpm摇床上，28°C，16小时，按菌液850 μ L +灭菌甘油150yL分装，-80°C保存。③转化前，取一管菌液，用接种针刮试培养物，在YEB + (50mg/L)+ Rif (50mg/L)固体培养基上划线，28°C倒置培养复苏菌落。④挑取单菌落，在新的YEB培养基上划线，28°C倒置培养2d，使农杆菌增殖，用灭菌小刀收集菌体，在AB + AS (50 μ M)液体培养基中，摇床上，200 rpm，28°C培养2 3小时。⑤选择结构疏松的愈伤组织浸入步骤7所得的农杆菌液中，20分钟后取出植物材料，用无菌水冲洗3遍，用灭过菌的滤纸吸干水份，接种于1/2 MS+ AS (50μΜ)固体培养基上，暗培养到愈伤组织周围肉眼能观察到农杆菌落。⑥用无菌水冲洗愈伤3遍，用灭过菌的滤纸吸干水份，接种于1/2 MS +Basta (5-10mg/L)固体筛选培养基上，25°C暗培养，至抗性愈伤增殖，20天继代一次。⑦抗性愈伤在MS+NAA(O. 01mg/L) +GA (O. lmg/L) +TDZ (O. 5-2 mg/L)固体培养基中诱导愈伤组织分化不定芽。
⑧将带有不定芽的愈伤转入MS+NAA (O. O lmg/L)+6-BA(2mg/L)固体培养基中进行增殖，诱导丛生芽。⑨待丛生芽长到一定程度后，选择生长键壮者稼接到砧木上。⑩转基因植株的PCR检测待植株长出3 4片复叶后，采小叶提取基因组DNA(小样法)，用含载体序列的Pl或P2引物和etrlr的特异引物进行PCR初步鉴定。 对检测阳性的植株进行常规培养，待月季开花后，切取鲜月季花，转基因的鲜月季花比普通月季花的瓶插寿命长5 10天。
权利要求
1.含有etrl基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于扩增拟南芥突变体etrl基因并克隆至表达载体pEASY-Tl上获得pEASY-Tl-etrl质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etrl基因片段，用同样的双酶切体系对PFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etrl基因片段和骨架片段用T4 DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etrl 双元表达载体。
2.按照权利要求I所述含有etrl基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于扩增拟南芥突变体etrl基因的正向引物为5’ - ttGGCGCGCCaaCTCCCCTTTTCTCCTTCTC-3’，其中GGCGCGCC是添加的酶切位点，tt、aa是添加的保护碱基，CTCCCCTTTTCTCCTTCTC是特异引物序列；扩增拟南芥etrl基因的反向引物为5’ - cgGGATCCcgCCTTTACATGCCCTCGTACA-3’，其中GGATCC是添加的酶切位点，eg、eg是添加的保护碱基，CCTTTACATGCCCTCGTACA是特异引物序列。
3.按照权利要求I或2所述含有etrl基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于所述拟南芥突变体etrl基因来自于编号为CS237的拟南芥突变体。
4.含有etrl基因的pFGC5941-etrl双元表达载体在延长鲜切花瓶插寿命中的应用。
5.延长鲜切花瓶插寿命的方法，其特征在于用含有etrl基因的pFGC5941-etrl双元表达载体转化根癌农杆菌LAB4404感受态细胞，采用根癌农杆菌介导的植物转基因方法将Atetrl基因导入鲜切花植物基因组，转化成功后常规培养，即可。
全文摘要
本发明公开了一种含有etr1基因的双元表达系统的构建方法及其应用，扩增拟南芥突变体etr1基因并克隆至表达载体pEASY-T1上获得pEASY-T1-etr1质粒，在该质粒的AscI和BamHI限制性内切酶位点用双酶切体系酶切后获得etr1基因片段，用同样的双酶切体系对pFGC5941质粒进行双酶切获得骨架片段，将etr1基因片段和骨架片段用T4DNA连接酶进行连接，成为环状质粒，得到pFGC5941-etr1双元表达系统，将该系统应用于鲜切花，可将鲜切花寿命延长5～10天。
文档编号C12N15/66GK102827859SQ20111016224
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者张凌云, 王济, 贝学军, 张一修, 钟广炎 申请人:贵州师范大学