专利名称：一种提高真菌活性代谢产物产量的方法
技术领域：
本发明涉及到一种提高真菌活性代谢产物产量的方法。
背景技术：
为促使微生物产代谢产物，往往都使用富营养的培养基来对微生物进行发酵培养。然而，对于可培养的微生物，其营养需求大多数仍是个谜，或者是了解得还不够全面。 微生物的培养基种类繁多，究竟选择何种培养基和培养方法，往往带有很大的主观性、随意性，甚至使得发酵条件的优化工作也难免处于盲目或半盲目状态。此外，对于某一种属的菌株在特定的培养基上将产生何种结构类型的化合物，也无从预测；目前活性代谢产物的研究，很多是建立在大范围的菌株筛选基础上，重复性研究、资源浪费明显增多；在常规培养条件下，很多活性代谢物产量低，结构复杂也不易于人工合成，药物的研发存在资源瓶颈问题。为解决这些日益凸显的问题，迫切需要人们深入研究微生物，包括细菌、真菌、放线菌等的培养技术与代谢规律，充分发掘它们的生源合成潜力，实现可人为调控的、具有化学结构多样性活性代谢产物的高效生产。有毒苯环芳香族化合物，例如苯，甲苯，邻和对位甲苯，苯甲酸，苯酚，硝基苯类， 氯代苯类，萘，甲基萘等的微生物降解多年来一直都是国际研究的热点。现已发现很多细菌、真菌和放线菌都能依靠其产生的酶，对苯环芳香化合物进行转化或降解。常见的微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、拜叶林克氏 |ifM (Beijernckia)lifM (Corynebacterium)、i细胃(Cyanobacteria) (Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和弧菌属(Vibrio)，以及酵母菌和白腐真菌等多种霉菌。这些微生物对这些结构相对简单的苯环芳香族化合物有强的耐受力，能够启动自身的调节系统，来抵抗这些化合物的“毒性”，并实现降解这一解毒过程。总体而言，目前有关苯环芳香族化合物的微生物降解研究文献很多，但主要是生物学家和环境学家在开展相关的研究，且工作集中于微生物的筛选、降解产物和降解途径的分析、酶以及相关基因的研究。苯环芳香族化合物能引起微生物的氧化应激，使细胞脂质和蛋白发生过氧化。细胞膜是一种液晶相(liquid-crystalline phase)的结构，具有动态调节功能。能通过酶活性的调节，以阻止脂质的过氧化反应，增加膜的流动性，维持膜结构，在氧化应激状态下，能激活一些结合在膜上的酶，使膜上不饱和脂肪酸的含量有显著的提高，不饱和脂肪酸具有清除过剩的活性氧的功能。非常明确的，微生物在添加了有毒的苯环芳香族化合物的培养基中生长，能引起过敏反应。过敏反应由多种生理生化反应组成，如形成抗生素，积累蛋白酶抑制物，合成和分泌降解底物的酶等，微生物的这些自动调节反应都可以阻止细胞遭破坏，微生物特定基因的表达能得到诱导，能开启新的生源合成途径，结果必将导致代谢产物的组成和含量改变，提高微生物活性代谢物的产量。可见，苯环芳香族化合物对微生物的活性代谢产物产生具有重要的调控作用。然而，至目前为止，国际和国内都没有相关的报道涉及到微生物代谢产物的变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用甲苯提高真菌活性代谢产物产量的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种提高真菌活性代谢产物产量的方法，采用底物诱导的方法，所述底物为甲苯。方法是往真菌的发酵培养基中添加甲苯。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明只需在现有的培养基中添加适量的甲苯，就能诱导真菌高产活性代谢产物。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1 甲苯诱导真菌As/^r^/Bm sp.高产活性吡嗪化合物一、海洋真菌Asper识sp.的培养
海洋真菌A^argiBM sp.是从南海软珊瑚中分离的，该菌培养基为葡萄糖10克，蛋白胨5克，酵母膏2克，粗海盐23克，水1升，pH=7. 5。真菌识sp.在该培养基中，28 °C，120转每分摇瓶培养。共培养60升，均分成2组。二、诱导物甲苯加入真菌Asper识7ΛΛ5 sp.培养液的方法
上述真菌Asper识7ΛΛ5 sp.，选取其中的1个培养组30升，在培养的第5天，加入甲苯， 2克/升。继续培养至第10天，再加入2克/升的甲苯。三、HAspergiIlns sp.在上述两种培养条件下代谢产物的提取、分离与鉴定 1.代谢产物的提取
未加甲苯和加入了的甲苯的培养组分别培养20天后，终止发酵。用乙酸乙酯分别对培养液提取3次，提取液浓缩，得到提取物。未加甲苯的培养组30升培养液经提取得到6. 6 克提取物，加入了甲苯的培养组30升培养液经提取得到9. 8克提取物。2.代谢产物的分离
代谢产物的分离采用硅胶柱层析方法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗；其中以体积比石油醚乙酸乙酯=3 1洗脱得到3，6- 二异丁基-2(1//)-吡嗪酮，以体积比石油醚 乙酸乙酯=1 :1洗脱得到3-异丁基-6-(1-羟基-2-甲基丙基)-2(1功_吡嗪酮。
基)-2(1//)-吡嗪酮
从未加甲苯的培养组中，分离得到3，6- 二异丁基-2 m _吡嗪酮(3，6-diisobuty 1-2 (LT) -pyrazinone)15 毫克，3-异丁基-6- (1-羟基-2-甲基丙基)_2 (LT)-吡嗪酮(3-isobu tyl-6-(l-hydroxyl-2-methylpropyl)- 2(L7) -pyrazinone)43 毫克。在力口了甲苯的培养
6_ 二异丁基-2(1功-吡嗪酮
异丁基-6-(l-羟基-2-甲基丙组中，分离得到3，6-二异丁基-2 (LT)-吡嗪酮615毫克，3-异丁基-6-(1-羟基-2-甲基丙基)-2(1功-吡嗪酮1126毫克。3-异丁基-6- (1-羟基-2-甲基丙基)_2 (LT)-吡嗪酮是重要的活性物质，具有抗动脉粥样硬化作用，以及促进植物，如大豆、小麦的生长的作用。3.代谢产物的鉴定
主要代谢产物的物理常数与波谱数据如下
3，6-二异丁基-2(1功-吡嗪酮白色固体，m. ρ· 127. 5-129°C ； IR (KBr), κ/cm"1: 3429， 3068， 2959， 2909， 2870， 1645， 1530， 1470， 1384， 1263， 1238， 1172， 1100， 957，889，806. 1H NMR (300MHz, CDCl3, TMS) δ 13. 2 (s, 1H)，7. 27 (s, 1H)，2. 72 (d, J=7. 2 Hz, 2H), 2. 62 (d, J=7. 2 Hz, 2H)，2. 22 (nonets, J=7. 2 Hz, 1H)，2. 21 (nonets, J=7. 2 Hz, 1H)，0.99 (d, J=7. 2 Hz, 6H)，0.96 (d, J=7. 2 Hz, 6H)。13C NMR(75MHz, CDCl3, TMS) : δ 153.4，152.1，136.2，124.1，41.8, 36.8, 27.0, 26.8, 22. 5 (2C)，22. 4 (2C)。3-异丁基-6-(l-羟基-2-甲基丙基)_2 (LT)-吡嗪酮白色固体，m. p. 153-154°C。IR (KBr), κ /cm1 3411，3054，2964，2929，2872，1650，1624，1531， 1469，1427，1384，1364，1348，1307，1237，1164，1133，1071，1035，1015，977， 866，830，801，752. 1H NMR (300MHz, CDCl3, TMS) : δ 11. 38 (s, 1Η)，7. 26 (s, 1Η)， 4. 27 (d, J=7. 0 Hz, 1H)，3. 32 (s, 1H)，2. 71 (dd, J=14. 0，7.0 Hz, 1H)，2. 64 (dd, J=14. 0, 7.0 Hz, 1H), 2. 20 (nonets, J=7. 0 Hz, 1H)，2. 04 (octet, J=7. 0 Hz, 1H)， 1. 05 (d, J=7. 0 Hz, 3H), 0. 96 (d, J=7. 0 Hz, 3H)，0. 96 (d, J=7. 0 Hz, 3H)，0. 91 (d, J=7.0 Hz, 3H)。13C NMR(75MHz, CDCl3, TMS) :158.6, 157.3，138.3，121.7，74.4, 41. 7, 34. 2, 26. 9, 22. 6, 22. 6, 18. 9, 17. I0通过在真菌识7ΛΛ5 sp.的培养液中加入甲苯，使3，6_二异丁基_2 (LT)-吡嗪酮的产率由0. 5毫克/升，提高到20. 5毫克/升，提高了 41倍；3-异丁基-6-(l-羟基-2-甲基丙基)-2 m ~吡嗪酮的产率由1. 43毫克/升，提高到37. 54毫克/升，提高了 26. 2 倍。
权利要求
1. 一种提高真菌活性代谢产物产量的方法，其特征在于采用底物诱导的方法，所述底物为甲苯。
全文摘要
本发明公开了一种提高真菌活性代谢产物产量的方法。本发明只需在现有的培养基中添加适量的甲苯，就能诱导真菌高产活性代谢产物。该方法具有成本低，条件温和，高效等优点，推广应用价值高。
文档编号C12R1/66GK102329820SQ201110165529
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者洪伟 申请人:洪伟