专利名称：一种黄檗转基因体系建立的方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因体系建立的方法。
背景技术：
黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)，别名黄波罗，为芸香科(Rutaceae)黄檗属(Phellodendron Rupr)植物。黄檗是古老的残遗植物，对研究古代植物区系，古地理及第四纪冰期气候有科学价值，是国家二级保护植物(崔丽莉等，2004)，具有重要的经济、药用和保护价值，木材纹理美观，切面有光泽，材质坚韧，耐水湿及耐腐性强，不翘不裂，用于军工、制造家具及工艺美术。树皮木栓可作工业软木塞、浮标、救生圈或用于隔音、隔热、防震等。内皮可作黄色染料的来源及药用在我国和日本，黄檗中的药用物质被当作一种天然药使用，抗侵袭肠功能的病菌，防燥及退热剂(Ikuta et al. 1998)。叶可提取芳香油；花是很好的蜜源；果实含有甘露醇及不挥发的油分，可供工业及医药用。由于人们盲目采扒黄檗树皮，造成大规模的破坏。加上木材砍伐量较大，也造成资源枯竭。目前我国的黄檗野生资源已受到严重威胁。种子繁殖能力低，萌芽率低，以及切断面生根能力低，在引种栽培上尚未能大面积推广。近年来，有关黄檗的植株再生体系建立研究已有报道，然而，目前还没有有关黄檗转基因体系的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄檗转基因体系建立的方法。黄檗转基因体系建立的方法按以下步骤实现一、将黄檗去皮后的成熟种子在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡30s lmin，灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，灭菌水冲洗3 5遍，再接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的MS培养基上培养1 3天；二、将含⑶S基因的载体pCAMBIA1303利用电转方法转到根癌农杆菌EHA105中， 获得含⑶S基因的工程菌，然后接种到LB培养基上培养至菌液的OD6tltl值为0. 5 1. 0，再稀释至菌液的0D_值为0. 1，以5000r/min的转速离心5min，弃上清后加入等体积的含^ig/ L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培养基并混勻，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再放入步骤一中培养后的种子，将种子末端的子叶先切去，然后沿着胚轴纵切成两半，侵染30min后取出种子接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L琼脂的MS培养基上培养1 3天，然后剥离胚乳并用灭菌水冲洗带子叶的下胚轴 3 5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的灭菌水中进行脱菌；三、脱菌后的种子接种到含10mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的MS培养基中培养1个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0. 5mg/L 6_苄氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/ L蔗糖和5. 5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在21°C培养室中培养6周后去掉覆盖的塑料膜，获得黄檗转基因再生植株，即完成黄檗转基因体系建立。本发明黄檗转基因体系建立的方法，可实现转基因黄檗的快速培育，为黄檗优良品种的开发奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的黄檗新品种，使该树种的生态效益、经济效益和社会效益得到迅速、充分发挥。本发明黄檗转基因体系建立的方法，所得黄檗转基因再生植株移栽成活率达 94 %，产生的后代遗传稳定性好，可极大地缩短林木育种周期，加速育种进程，创造新种质， 选育新品种，对营造优质人工林，缓解木材供需矛盾，保护生态环境具有重要意义。
图1为具体实施方式
四中PCR检测扩增的电泳图，其中M表示Marker DL2000，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1-4表示转基因植株；图2为具体实施方式
四中RT-PCR 检测的电泳图，其中M表示MarkerDL2000，泳道1_4表示转基因植株。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式黄檗转基因体系建立的方法按以下步骤实现一、 将黄檗去皮后的成熟种子在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡30s lmin，灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为1 %的Natno溶液中消毒10 20min，灭菌水冲洗 3 5遍，再接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的 MS培养基上培养1 3天；二、将含⑶S基因的载体pCAMBIA1303利用电转方法转到根癌农杆菌EHA105中， 获得含⑶S基因的工程菌，然后接种到LB培养基上培养至菌液的OD6tltl值为0. 5 1. 0，再稀释至菌液的0D_值为0. 1，以5000r/min的转速离心5min，弃上清后加入等体积的含^ig/ L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培养基并混勻，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再放入步骤一中培养后的种子，将种子末端的子叶先切去，然后沿着胚轴纵切成两半，侵染30min后取出种子接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L琼脂的MS培养基上培养1 3天，然后剥离胚乳并用灭菌水冲洗带子叶的下胚轴 3 5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的灭菌水中进行脱菌；三、脱菌后的种子接种到含10mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的MS培养基中培养1个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0.5mg/L 6_苄氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/ L蔗糖和5. 5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在21°C培养室中培养6周后去掉覆盖的塑料膜，获得黄檗转基因再生植株，即完成黄檗转基因体系建立。本实施方式中根癌农杆菌EHA105购买自东北林业大学林木遗传育种实验室。本实施方式中1/2MS培养基即MS培养基中大量元素浓度减半，成分如表1所示。表 权利要求
1.一种黄檗转基因体系建立的方法，其特征在于黄檗转基因体系建立的方法按以下步骤实现一、将黄檗去皮后的成熟种子在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡 30s lmin，灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为1 %的NaClO溶液中消毒10 20min,灭菌水冲洗3 5遍，再接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的MS培养基上培养1 3天；二、将含GUS基因的载体pCAMBIA1303利用电转方法转到根癌农杆菌EHA105中，获得含⑶S基因的工程菌，然后接种到LB培养基上培养至菌液的OD6tltl值为0. 5 1. 0，再稀释至菌液的OD6tltl值为0. 1，以5000r/min的转速离心5min，弃上清后加入等体积的含％ig/L 苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培养基并混勻，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再放入步骤一中培养后的种子，将种子末端的子叶先切去，然后沿着胚轴纵切成两半，侵染30min后取出种子接种到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L琼脂的MS培养基上培养1 3天，然后剥离胚乳并用灭菌水冲洗带子叶的下胚轴 3 5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的灭菌水中进行脱菌；三、脱菌后的种子接种到含10mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、 0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的MS培养基中培养1个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/ L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在21°C培养室中培养6周后去掉覆盖的塑料膜，获得黄檗转基因再生植株，即完成黄檗转基因体系建立。
2.根据权利要求1所述的一种黄檗转基因体系建立的方法，其特征在于步骤一中将黄檗去皮后的成熟种子在超净工作台内用体积浓度为70%的酒精浸泡30s lmin，灭菌水冲洗2 3遍，然后转入质量浓度为的NaClO溶液中消毒10 20min。
3.根据权利要求1所述的一种黄檗转基因体系建立的方法，其特征在于步骤四中栽培基质按体积份数比由1份灭菌的沙子和3份灭菌的泥土组成。
全文摘要
一种黄檗转基因体系建立的方法，它涉及一种转基因体系建立的方法。方法一、成熟种子预处理；二、载体pCAMBIA1303利用电转方法转到根癌农杆菌EHA105中，获得含GUS基因的工程菌，然后制备侵染液，侵染后脱菌；三、获得抗性芽；四、抗性芽伸长及生根并移栽，获得黄檗转基因再生植株，即完成。本发明黄檗转基因体系建立的方法，可实现转基因黄檗的快速培育，为黄檗优良品种的开发奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的黄檗新品种，所得黄檗转基因再生植株移栽成活率达94％，产生的后代遗传稳定性好，可极大地缩短林木育种周期，加速育种进程，对营造优质人工林，缓解木材供需矛盾，保护生态环境具有重要意义。
文档编号C12N15/82GK102260705SQ201110166079
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者刘桂丰, 刘立辉, 周晨光, 李成浩, 李春燕, 杜佳, 杨静莉, 赵波, 靳春莲 申请人:东北林业大学