专利名称：用于发酵产冠菌素的红糖培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵产冠菌素的红糖培养基。
背景技术：
冠菌素(coronatine，COR, C18H25NO4, 319)，是由植物病菌分泌于细胞外的植物生长物质，结构及活性与茉莉酸(Jasmonic acid，JA，C12H18O3)和脱落酸(Abscisic acid, ABA, C15H20O4)相近，包括一个含氨基酸的冠烷酸(coronamic acid)和一个聚酮结构的冠菌酸 (coronafacic acid)，以酞胺键连结。作为细菌(如丁香假单胞菌)的次级代谢产物，合成与菌体生长直接相关，传统菌株产冠菌素活性一直存在低温(最适温度为18°C)限制，因此，产冠菌素的发酵条件需要在菌体生长与冠菌素积累两方面平衡，
经典的冠菌素发酵培养基为 Hoitink-Sinden minimal medium optimized for coronatine medium(HSC medium)磷酸氢二钾 4. lg、磷酸二氢钾 3. 6g、氯化铵 lg、七水合硫酸镁0. 2g、氯化高铁2 μ Μ、葡萄糖20g。在此基础上,碳源主要为葡萄糖(个别使用萘碳源进行菌种筛选)，依据菌种等因素差异，葡萄糖含量为10 20g/L ；常用的氮源为氯化铵、蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏和玉米浆等，氯化铵的培养基浓度均为lg/L，其他有机氮源的使用并没有显示出一定的规律性；另外由于冠菌素在不同PH下显示不同的溶解性，在酸性条件下，不溶于水，而易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中，碱性条件下形成钠盐和钾盐易溶于水，因此发酵液的PH极大的影响冠菌素的积累，并且对菌体的生长也作用明显。但传统培养基主要存在三大缺陷(1)冠菌素发酵菌株基本为丁香假单胞菌属的致病变种，而培养基没有考虑菌株的植物源性；(2)标准HSC培养基菌体生长速度缓慢(3) 传统培养基的成分过于单一，利于研究成分影响，但是不利于冠菌素的有效积累。
发明内容
解决的技术问题
针对以上问题，本发明的目的在于提供一种冠菌素发酵的新型培养基，通过分析菌株的植物源性，兼顾发酵前期菌体生长和发酵后期冠菌素积累，提高冠菌素的积累效率。技术方案
用于发酵产冠菌素的红糖培养基(Brown sugar medium optimized for coronatine medium, BSC medium)，由下述物质组成l%wt 4%wt红糖、1 15 μ M氯化高铁、 0. 2%wt 0. 6%wt 磷酸氢二钾、0. 05%wt 0. 6%wt 磷酸二氢钾、0. 01%wt 0. 5%wt 氯化铵、 0. 001%wt^0. l%wt七水合硫酸镁，余量为水。发酵菌株为桑丁香假单胞菌(Aeyi/offloaas syringae pv. ori)M4_13菌株，保藏日期为2010年2月1日，保藏登记号为CGMCC No. 3621。种子培养基为LB培养基胰化蛋白胨1. 0%，酵母粉0. 5%，氯化钠1. 0%，pH7. 2。有益效果
本发明提供的新型冠菌素发酵培养基以红糖作为培养基碳源，在低温(10°c -20°c)区域，提高了桑丁香假单胞菌(/^ewi/offloaas syringae pv.M4_l3的生长速度。红糖作为一种植物源(甘蔗)产物，不仅提供了菌体生长的碳源，而且红糖中含有大量维他命和电解质成分，可提供菌体生长的微量元素，结果显示可以有效促进冠菌素的积累。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1
本实施例说明桑丁香假单胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以HSC 培养基培养，其生长速度与温度的相关性。HSC培养基每升培养基组成磷酸氢二钾4. lg、磷酸二氢钾3. 6g、氯化铵lg、七水合硫酸镁0. 2g、氯化高铁2 μ M、葡萄糖20g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接种量接种于培养基中，分别于10°C、20°C、30°C、32°C、37°C和40°C下培养，转速200rpm，定时取样，于0D550nm测定发酵液浓度，取其生长对数期斜率m，得生长速率
log 2
其中 k1(l=0. 0316，Ii2tl=O. 2098,k30=0. 7141，k32=0. 7063，k37=0. 6220 和 k4(l=0. 0316，下标表示该温度下的K值。实施例2
本实施例说明桑丁香假单胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以BSC 培养基培养，其生长速度与温度的相关性。BSC培养基每升培养基组成磷酸氢二钾3. 6g、磷酸二氢钾lg、氯化铵lg、七水合硫酸镁0. 2g、氯化高铁4μ M、红糖20g，将桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接种量接种于培养基中，分别于10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、32°C、 37°C和40°C下培养，转速200rpm，定时取样，于0D550nm测定发酵液浓度，取其生长对数期斜率m，得生长速率
其中 k10=0. 1304，k15=0. 1989，k20=0. 3604，k25=0 . 6 2 0 5，k30=0. 8243，k32=0. 9780， k37=0. 8260和k4Q=0. 2392，下标表示该温度下的K值。实施例3
本实施例说明桑丁香假单胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以HSC 培养基，发酵合成冠菌素。HSC培养基每升培养基组成磷酸氢二钾4. lg、磷酸二氢钾3. 6g、氯化铵lg、七水合硫酸镁0. 2g、氯化高铁2μΜ、葡萄糖20g，将桑丁香假单胞菌syringae pv.mori)M4-13以1%的接种量接种于培养基中，于18°C下培养，转速200rpm，定时取样，取发酵液经HPLC检测，浓度为32mg/L。实施例4
本实施例说明桑丁香假单胞菌O^ewi/offloaas syringae pv. ) M4-13菌株以BSC
培养基培养，发酵合成冠菌素。BSC培养基每升培养基组成磷酸氢二钾3. 6g、磷酸二氢钾lg、氯化铵lg、七水合硫酸镁0. 2g、氯化高铁4μ M、红糖20g，将桑丁香假单胞菌(I^seudomonas syringae pv. mori)M4-13以1%的接种量接种于培养基中，于18°C下培养，转速200rpm，定时取样，取发酵液经HPLC检测，浓度为149mg/L。
权利要求
1.用于发酵产冠菌素的红糖培养基，其特征在于由下述物质组成l%wt 4%wt红糖、1 15 μ M氯化高铁、0. 2%wt 0. 6%wt磷酸氢二钾、0. 05%wt 0. 6%wt磷酸二氢钾、 0. 01%wt"0. 5%wt氯化铵、0. 001%wt"0. l%wt七水合硫酸镁，余量为水。
全文摘要
用于发酵产冠菌素的红糖培养基，由下述物质组成1%wt～4%wt红糖、1～15μM氯化高铁、0.2%wt~0.6%wt磷酸氢二钾、0.05%wt~0.6%wt磷酸二氢钾、0.01%wt~0.5%wt氯化铵、0.001%wt~0.1%wt七水合硫酸镁，余量为水。发酵菌株桑丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.mori)M4-13菌株，兼顾发酵前期菌体生长和发酵后期冠菌素积累，提高了冠菌素的积累效率，生物合成冠菌素产量由原来的32mg/L提高到149mg/L。
文档编号C12P13/02GK102250975SQ20111016776
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者吕荣宾, 吴福安, 张生杰, 梁垚, 潘飞, 王俊 申请人:江苏科技大学