专利名称：一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗氧化肽的制备方法，具体为一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，活性氧和自由基导致的各种疾病严重危害了人类的健康，已经引起了社会各界的广泛关注。近年来，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势，而各种原料产生的抗氧化肽由于其低毒、 高效等特点，成为国内外研究的热点。目前，以酶水解蛋白质获得抗氧化肽的方法得到了很大的发展，各种不同来源的蛋白质在专一酶的作用下，得到了许多具有高抗氧化活性的肽段。近年来，从廉价易得的动植物原料制备抗氧化肽的研究有很多，这些原料主要有大豆蛋白、玉米蛋白、麦胚蛋白、乳蛋白、鱼类蛋白等，此外在牛奶蛋白、家蝇幼虫蛋白等动物蛋白原料，以及黑米、菜籽、灵芝、 枸杞等植物蛋白原料中均获得了具有抗氧化作用的活性肽。由此可见，生产抗氧化肽的原料范围非常广泛。南瓜籽作为南瓜的副产品，蛋白质含量高达30% 40%，南瓜籽含有平衡性很好的各种必需氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸和儿童必需的组氨酸，并且有与人体所需氨基酸组成模式相似的必需氨基酸比例。南瓜籽蛋白质在人体中的吸收率可达88 % 97 %， 生理效价为73 % 86 %，蛋白质的品质好、含量高，可见南瓜籽是一种优质的、廉价易得、产量巨大的植物蛋白资源。但是目前这些籽资源大多被用作饲料或被堆积甚至直接废弃，不仅造成资源的浪费，而且造成环境污染。其实南瓜籽经过清理、去皮后，可采用压榨法、浸出法、超临界(X)2萃取法等方法提取油脂，同时对提取的粗油进行精炼，即可得到香味浓郁、 风味独特的南瓜籽油，其品质可以和大豆色拉油等油脂相媲美。提油后的饼粕含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等，在美国和加拿大早有将其加工成高蛋白的动物饲料或肥料的报道，目前开发的重点则是其中的蛋白质。国内对榨油后的南瓜籽饼粕未能充分开发利用， 还处于起步阶段。李燕杰等对南瓜籽饼粕的可开发性和其中蛋白质资源的综合利用进行综述，提出了南瓜籽饼粕开发的两种思路，即作为全部蛋白原料和作为部分蛋白原料，指出南瓜籽蛋白产品和蛋白饮料的开发具有一定的市场前景。但是目前国内外对于南瓜籽多肽及其生理活性的研究几乎没有，还未见有将南瓜籽蛋白抗氧化肽作为抗氧化剂的报道，这对南瓜籽饼粕资源的开发具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原料来源广泛、制造成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制备方法。本发明是采用如下技术方案实现的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤(1)南瓜籽分离蛋白溶液的制备以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为4 8%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均勻；(2)酶解将步骤(1)得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热5 15分钟使蛋白变性，冷却后调节PH到2. 5 3. 5，然后加蛋白酶500(T8000U/g，在45 55°C水浴中水解2 6h，水解过程中保持PH恒定；(3)灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。所述碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是温度为4(T50°C，料液比为 1 3(Γ40，pH值为l(Tll，浸提时间为1.5Uh。所述碱溶酸沉淀法为本领域公知技术， 本发明通过单因素和正交实验确定了碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的最佳工艺条件是条件为温度为50°C，料液比为1 30，pH值为11，浸提时间为1.5h，在此条件下蛋白质的提取率达到85. 52%，纯度为91. 07%。所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或风味蛋白酶或2709碱性蛋白酶或 Alcalase2. 4L碱性蛋白酶中的任意一种。上述五种蛋白酶均为现有公知商品，其中酸性蛋白酶至少可从宁夏和氏璧生物技术有限公司购得，酶活力> 10万，木瓜蛋白酶至少可从广西南宁庞博生物工程有限公司购得，酶活力为80万U/g，风味蛋白酶至少可从广西南宁庞博生物工程有限公司购得，2709碱性蛋白酶至少可从天津诺奥科技发展有限公司购得，酶活力为20万U/g，Alcalase2. 4L碱性蛋白酶至少可从丹麦Novo Nordisk公司购得，酶活力为 2. 4AU-A/g。所述超滤所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0. 15^0. 25MPa、料液质量浓度为广3%、料液pH为6 8，操作时间为5(Γ70分钟。所述离心时转速为450(T5500r/min，离心时间为10 30分钟。本发明所述南瓜籽抗氧化肽的最佳制备方法，包括以下步骤(1)南瓜籽分离蛋白溶液的制备以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为5%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均勻；(2)酶解将步骤(1)得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2. 5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50°C水浴中水解证，水解过程中保持pH恒定；(3)水解完成后迅速煮沸10 分钟，使酶失活，冷却后在转速为5000r/min的条件下离心20分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0. 2MPa、料液质量浓度为2%、料液pH 为7，操作时间为60分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。上述步骤中，脱脂南瓜籽粉的制备方法为现有公知技术，本发明提供以下最佳方法将去皮南瓜籽在60°C烘箱中烘4小时，使水分含量在5%以下，然后粉碎，利用超临界CO2 萃取技术进行脱脂，脱脂条件为萃取釜压力25MPa，萃取温度45°C，分离柱压力lOMPa，分离温度 50 0C，CO2 流量 2. 4-4. 2L/h。本发明通过以下实验及数据分析得出上述工艺步骤的最佳参数，具体过程为 一、实验方法
1、测定方法
1.1蛋白酶活力的测定
采用福林-酚法测定蛋白酶活力
1. 2水解度的测定
水解度(腿)=游离氨基氮含量 ^总氮含量1勸
其中游离氨基氮含量用甲醛电位滴定法，总氮含量用微量凯氏定氮法。1. 3 DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)清除率的测定
DPPH自由基清除率采用比色法，具体过程为在反应管中加入aiil 0. 2mmol/L的 DPPH乙醇溶液，再加入aiil不同浓度的南瓜籽蛋白水解液，混合均勻，室温下避光反应 50min后，于517nm波长处测定吸光度。同时以^iil DPPH溶液与^iil蒸馏水混合后的吸光度为对照组；以ani蒸馏水与ani乙醇混合后的吸光度为空白组。清除率(%)= [1-(A1-A2 )/A3] XlOO
式中A1为加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2为空白水解液的吸光度；A3为未加水解液时DPPH溶液的吸光度。2、南瓜籽蛋白酶解液的制备
配置一定浓度的南瓜籽分离蛋白溶液，在沸水中加热处理10 min，冷却至酶解反应的最适温度，调节一定的PH值，然后按一定比例加入蛋白酶，反应过程中使pH值保持恒定。反应到预定时间，沸水浴灭酶10 min，冷却后离心分离，上清液置于冰箱中待用。3、蛋白酶的筛选实验
3.1单酶水解
参照厂家提供的酶最适反应条件，选定底物(南瓜籽分离蛋白溶液，以下同)浓度为 0. 05g/mL(即质量浓度为5%)，充分搅拌后，100°C水浴IOmin使蛋白变性，冷却后调节pH到规定值，加酶量为2000U/g，水解4h。水解过程中保持pH基本恒定。水解完迅速煮沸IOmin 使酶失活，冷却离心后分别测定水解度和DPPH清除率。4、单因素实验设计
4.1酶添加量的确定
配置底物浓度为0. 05g/mL的蛋白溶液，在温度为50°C，pH为3. 5，加酶量分别为500、 2000、4000、6000、8000 U/g的条件下水解4 h。以DPPH清除率为第一指标，水解度为第二指标，确定最佳的加酶量。4. 2最适温度的确定
分别在温度为30、40、45、50、55 °C的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最适温度。4. 3最适pH值的确定
分别在pH2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最适PH值。4. 4底物浓度的确定
分别在底物浓度为0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 10 g/ml的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最佳底物浓度。4. 5酶解时间的确定
分别测定水解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h时的DPPH清除率，其它同上述操作，确定最佳的水解时间。5、酶解工艺条件的优化在单因素实验的基础上，利用MINITAB15. 0软件设计5因素两水平的Plackett-Burman 筛选试验，从5个因素中筛选出具有显著性的因素，然后采用Box-Behnken中心组合试验对其工艺参数进行优化。
二、结果与分析 1、蛋白酶的筛选 1.1标准曲线的绘制
以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如
图1，得到回归方程 y=0. Olllx+O. 0461，R2=O. 9996，线性良好，符合测定酶活力的要求。 1.2蛋白酶活力的测定 由于不同产家生产的蛋白酶采用不同的单位符号，给实际操作带来不便，此外随着储藏时间和条件的影响，实际应用时的酶活力已经和出厂时有了一定的差别，故本发明采用福林酚法统一测定实验选取的各种蛋白酶的实际活力，以便于操作，结果见表1。从表1中可以看出，不同的蛋白酶所表现的酶活力具有较大的差异。由于植物蛋白的酶解比动物蛋白难，故有必要进行蛋白水解酶的筛选，以期获得能够产生较高活性的抗氧化肽的酶制剂。1. 3单酶的筛选
从图2可以看出，5种蛋白酶对南瓜籽蛋白的酶解效果有差异。从抗氧化活性来看，C (酸性蛋白酶)效果最好，D (木瓜蛋白酶)和E (风味蛋白酶)相当；从水解度来看，A (2709 碱性蛋白酶)和B (Alcalase2.4L碱性蛋白酶)两种酶占优势。本实验的目的是制备抗氧化肽，因此以抗氧化活性为第一指标，水解度为第二指标，选择C (酸性蛋白酶)作为第一步酶解用酶。2、酸性蛋白酶酶解的单因素结果 2. 1加酶量对酶解效果的影响
由图3看出，南瓜籽蛋白酶解液对DPPH的清除率和水解度都随着酶用量的增加而增大。当加酶量超过6000 U/g时，清除率增加变得缓慢。这可能是由于加酶量小于6000 U/ g时，在底物浓度一定的情况下，增加的酶量未使底物浓度饱和，随着加酶量的增大，反应速度越快，蛋白质水解度也越高，得到的多肽液清除DPPH的能力越强。而当加酶量继续增加时，底物浓度相对较低，酶分子过饱和，所以水解程度变化不大，活性多肽的量不再增加。同时，酶量的增加也会使生产成本大大增加，所以本发明选择酶用量为500(T8000U/g较为合适，最佳为6000 U/g。2. 2温度对酶解效果的影响
温度对酶催化反应的影响是多方面的，温度提高会影响酶的稳定性和底物转化成产物的速度。由图4可知，随着温度的升高，水解度程度加大，DPPH清除能力增强，50 °C左右时南瓜籽蛋白酶解液表现出最强的抗氧化活性，这可能是因为随着温度的升高，酶促反应的速度加快，体系中活性多肽的含量增加；当温度高于50 ！时，蛋白酶结构发生改变，酶活降低，使活性肽的含量保持在一定水平。因此较适宜的酶解温度为45飞5 °C，最佳为50 "C。2. 3 pH值对酶解效果的影响
PH能影响酶活性部位的解离和底物蛋白的解离，从而直接影响了酶与底物蛋白的结合与催化，每个催化反应都有一个最适宜的PH，此外，不同的反应条件对酶解产物的结构、性质有着不同的影响，从而使产物表现出不同的清除DPPH自由基的活性。由图5可见，水解度随着PH的增大先增加后减小，在pH=3. 5左右酶活性最高，水解度最大。酶解液的DPPH 清除能力随着PH值的升高而下降并逐渐趋于平缓，旨在得到抗氧化活性较高的多肽片段， 因此选择pH2. 5^3. 5作为较合适的pH值，最佳为2. 5。2. 4底物浓度对酶解效果的影响
由图6所示，水解度随着底物浓度的增加而减小，酶解液的DPPH清除能力却先增大后减小，在0.06 g/ml左右达到最大。考虑到在低浓度时，溶液太稀不利于酶分子与蛋白质分子相互作用，而实际生产也希望底物浓度较大，获得较多的活性多肽；但是浓度过高，溶液比较粘稠，也会阻碍酶与蛋白之间的充分作用，使水解度降低。故初步确定酶解体系的较适底物浓度为0. 04 0. 08 g/ml (即质量浓度为4 8%)，最佳为0. 06 g/ml (质量浓度为6%)。2.5时间对酶解效果的影响
由图7可以看出，随着时间的延长，水解度和DPPH清除率都增大，但是4 h以后DPPH 清除率增加缓慢。由于在反应的初始阶段，蛋白酶活力最强，能与底物充分结合，而且底物浓度最大，酶作用位点也最多，此时水解度和酶解液活性显著增加。随着反应的继续进行， 底物浓度减少，产物浓度增加，对酶催化反应起到抑制作用，同时酶活力也随时间的延长而降低。这些因素共同导致酶解液的活性趋于稳定，因此选择较适合的反应时间为2飞h，最佳为4 h。3、Plackett-Burman设计确定关键影响因素 3. 1 PB实验设计与结果
根据单因素实验得结果，设计了 N= 12的Plackett-Burman筛选实验。每个因子取高 (+ 1)低(-1)两个水平，以DPPH自由基清除率为响应值Y，结果如表2所示。对PB实验结果拟合模型的回归方程进行方差分析，结果见表3。各因素的效应评价及系数显著性检验见表4，P小于0. 05，说明该因素是显著的，可进一步对其进行考察。表2 PB实验设计与结果
权利要求
1.一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)南瓜籽分离蛋白溶液的制备以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为4 8%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均勻；(2)酶解将步骤(1)得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热5 15分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2. 5 3. 5，然后加蛋白酶500(T8000U/g，在45 55 °C水浴中水解2飞h， 水解过程中保持PH恒定；(3)灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是温度为4(T50°C，料液比为1 3(Γ40，ρΗ值为l(Tll，浸提时间为1. 5 2. 5h。
3.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或风味蛋白酶或2709碱性蛋白酶或Alcalase2. 4L碱性蛋白酶中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述超滤所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0. 15^0. 25MPa、料液质量浓度为广3%、料液pH为 6 8，操作时间为50 70分钟。
5.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述离心时转速为450(T5500r/min，离心时间为10 30分钟。
6.根据权利要求1至5所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)南瓜籽分离蛋白溶液的制备以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为5%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均勻；(2)酶解将步骤(1)得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热10分钟使蛋白变性， 冷却后调节pH到2. 5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50°C水浴中水解证，水解过程中保持 PH恒定；(3)水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5000r/min的条件下离心20分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为 0. 2MPa、料液质量浓度为2%、料液pH为7，操作时间为60分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。
全文摘要
本发明涉及一种抗氧化肽的制备方法，目的在于提供一种原料来源广泛、成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制备方法，(1)南瓜籽分离蛋白溶液制备以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成南瓜籽分离蛋白溶液；(2)酶解将南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5~3.5，然后加蛋白酶5000~8000U/g，在45~55℃水浴中水解2~6h；(3)灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。所得抗氧化肽具有显著的还原能力，较强的清除自由基的能力，应用广泛，具有显著的社会效益和经济效益；酶解工艺条件最优，提高原料的利用率；原料来源广泛，实现了废物利用的目的。
文档编号A23J3/34GK102197856SQ20111016935
公开日2011年9月28日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者刘艳荣, 范三红 申请人:山西大学