专利名称：一株枯草芽孢杆菌及其在防治白粉病的生防制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物农药领域，主要涉及一株枯草芽孢杆菌和其工业制备方法，本发明还涉及一种防治瓜类、烟草、蔬菜、草莓等经济作物白粉病的的生防制剂。
背景技术：
白粉病菌的种类多、分布广，目前在世界上已正式命名的大约有650多种。分属于3个属、6个种的真菌都可引起瓜类白粉病。瓜类白粉病主要由单囊壳白粉菌 (Podosphaera xanthii，原名为 Sphaerotheca fuliginea)禾口二3^( )" (Golovinomyces cichoracearum，原名为Erysiphe cichoracearum)引起的，是一种世界性病害，各种栽培条件下均可发生，常年危害，严重阻碍了瓜类的绿色生产。白粉病菌生理小种众多，分化演替快，在不同地区和不同瓜类作物上的分布也不尽相同。迄今为止，单囊壳白粉菌生理小种有 11个，二孢白粉菌生理小种有2个。它具有气流传染、潜育期短、再侵染频繁、流行性强等特点。该病对瓜类生产带来严重的危害，在苗期造成瓜类生长减弱甚至死亡，生育期造成瓜果畸形，导致严重的经济损失。因该病菌是专性寄生菌，这为室内防治该病的研究带来了很大的困难。在我国，白粉菌G. cichoracearum主要分布在黑龙江、甘肃、青海、新疆、江苏；而 P. xanthi主要分布在河北、内蒙、辽宁、江苏、台湾、广西、云南、四川等地。目前，在我国一些地区也有瓜类白粉病菌的种类与生理小种鉴定的研究报道，如在杭州地区鉴定出单囊壳白粉菌的生理小种2 ；在北京地区初步鉴定出单囊壳白粉菌的生理小种1和2F，优势生理小种为2F ；在海南三亚地区初步鉴定出单囊壳白粉菌的生理小种1和2F，优势生理小种为 2F，而且还可能存在新的生理小种；新疆和甘肃皋兰地区鉴定出单囊壳白粉菌的生理小种均为1 ；而长春地区鉴定出单囊壳白粉菌是该地区的主要白粉病菌。两种白粉菌都是严格的专性寄生菌，它们的寄主范围都很广，除葫芦科作物外，还可以侵染其它科的多种植物。两种菌均具有明显的寄生专化性，有许多不同的变种和生理小种，非瓜类作物上同属同种的白粉菌，不一定能侵染瓜类作物。由于白粉病菌的生理小种分化严重，且易产生抗药性。同时，由于农业设施的不断兴起，为白粉病的猖獗传染提供了更有利的环境条件，该病害造成的经济损失在逐年增加。在农业生产上，人们主要采用化学农药防治此病，如杜邦福星乳油，烯哇醇、硫悬浮剂、 多硫悬浮剂、甲基托布津、百菌清、粉必清、绿颖、敌死虫多抗灵、特富灵、粉锈宁、瑞毒铜、多菌灵、氟硅唑微、仙生、世高等。但现已发现白粉病菌对苯丙咪唑类、有机磷类、羟基嘧啶类、 甲氧基丙稀酸酯类和苯氧基喹啉类产生了抗药性，很难达到预期的防治效果。化学农药发展到20世纪60年代，“农药公害”问题如农药的高残留、高抗病虫害的猖獗发生、天敌生物群落的严重破坏及农业生态环境的污染等不断暴露，且日益严重，在国际上引起了轰动，使农药的发展发生了转折，引出了生物农药。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物对害虫、病菌、杂草、线虫、鼠类等有害生物进行防治的一类农药制剂，或者是通过仿生合成具有特异作用的农药制剂。随着社会的发展、科技的进步及公众环保意识的增强，减少使用化学农药，保护人类生存环境的呼声日益高涨，研究开发利用生物农药防治农作物病虫害，发展成为国内外植物保护科学工作者的重要研究课题之一。生物农药具有安全、有效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合。因此，近年来我国生物农药的研究开发也开始呈现出新的局面。生物农药在病虫害综合防治中的地位和作用显得愈来愈重要。生防菌如赌蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)、哈茨木霉(Truchoderma harziamum)、Tilleiopsis pallescens、Τ· washingtonensis、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、坚强芽孢杆菌(B. firmus)、链霉菌 (Streptomycete spp)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophlus)等对白粉病都有良好的防治效果。但生防菌株对白粉病的防效多数来源于温室实验结果，而绝大多数菌株在露天的大田中，由于受到紫外线或其他环境因素的影响，很难对白粉病的有良好的防治效果。瓜类作物在百姓的“菜篮子工程”中占有重要的地位。通过生物防治的方法控制白粉病的发生，对提高瓜类作物的品质、减少化学农药的使用、促进农业生态系统的和谐发展有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是为了适应有机农业的发展需求，提供一种枯草芽孢杆菌，可以有效解决现有技术所存在的问题。本发明的另一目的在于提供该枯草芽孢杆菌的工业制备及其应用。本发明的另一目的在于提供含有上述枯草芽孢杆菌的生防制剂。本发明的另一目的在于提供所述生防制剂的使用方法。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBRl已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国北京朝阳区北辰西路1号院；保藏编号为 CGMCC No. 4915 ；保藏日期2011 年 05 月 27 日。本发明的菌株为枯草芽孢杆菌FBR1，分离自山东邹平县城郊区的黄瓜根际中。该菌株的分离方法是称根际土 10g，用无菌水进行梯度稀释至10-6到10-5，取100 μ L涂在 NA固体平板上(NA培养基为牛肉浸膏3g，酵母浸膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼胶15g ； 蒸馏水1000. 0ml，pH6. 8-7. O。)，挑去单克隆，并进行纯化，最终得到该菌株。该菌株的特征如下(1)在马铃薯蔗糖培养基上，生长速度快，12-M个小时可以长满直径为9厘米的培养皿，并呈明显的同心圆状，菌落呈脓状，在菌落边缘有褶皱；( 在LB培养基上，菌落呈脓状，透明，凸起馒头状，表面光滑，不易产生褶皱；菌体呈球棒状，大小为0. 5-0. 9 X 1. 9-2. 5 微米，鞭毛端生，具有运动性；产生芽孢，芽孢中生，呈椭圆型。( 该菌株在植物叶面定殖能力强，具有杀菌防病的作用；(4)好氧型，革兰氏染色阳性；可以利用多种单糖或二聚糖， 可水解淀粉、纤维素、酪素及明胶，低于5°C或高于55°C都不能正常生长。本发明还公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBRl的工业生产方法，发酵培养基为玉米粉0.8%、黄豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.8%、碳酸钙0. 15 %、硫酸镁0.02%、消泡剂0.005 %、pH 7.0，用水定容；发酵温度为，通气量为0. 2v/v/min-0. 4v/v/min，搅拌速度为100-150转/分钟，发酵时间为M-36小时。优选的是所述发酵培养基中还包含蔗糖2. 0%。
本发明还公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBRl的工业生产方法，本发明还公开了该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBRl在防治农作物白粉病中的应用。优选的是所述农作物为瓜类、蔬菜、烟草或者草莓。优选的是所述白粉病是由单囊壳白粉菌引起的。优选的是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。本发明还公开了一种生防制剂，所述生物制剂含有保藏号为CGMCCNo. 4915的枯草芽孢杆菌FBRl。本发明还公开了上述生物制剂的田间使用方法，将所述生物制剂稀释0-1000倍。优选的是将所述生防制剂稀释300-500倍。本发明的可以用于瓜类白粉病生物防治的菌株-FBR1，通过工业发酵得到其活性发酵液，用于大田瓜类白粉病的生物防治，而且治愈效果良好。该发明易于工业化生产、不产生工业三废、对环境安全，对有机农业发展的有着重要意义。
附图1示出了本发明菌体在显微镜下的形态。本发明菌体的保藏信息如下保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏日期2011年05月27日；保藏编号CGMCCNo. 4915。
具体实施例方式以下实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。实施例1菌株活化及扩繁将菌株在LB固体培养基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化钠，pH值 7. 0左右，1. 5%琼脂)上划线活化，并在LB液体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值7. 0左右)扩繁，得到发酵种子。工业发酵培养基玉米粉1%、黄豆粉！^^、酵母粉化！^^蛋白胨化日^^磷酸二氢钾 0.8%、碳酸钙0. 15%、硫酸镁0.02%、消泡剂0.005%、蔗糖2.0%、pH 7. 0 ；发酵条件发酵温度为^_35°C、通气量为0. 4v/v/min，搅拌速度为100转/分钟、M小时；在发酵过程中，间隔2个小时取样1次，测定pH值，观察菌落形态。在芽孢数达到5%时，添料一次，在芽孢数达到90%时，停止发酵，并通过显微镜观察确定是否为本生物制剂，并用血球计数板来统计菌体数，每毫升中含有2亿个活菌量。所得发酵液即为本发明的生物制剂。实施例2菌株活化及扩繁将菌株在LB固体培养基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化钠，pH值7. 0左右，1. 5%琼脂)上划线活化，并在LB液体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值7. 0左右)扩繁，得到发酵种子。将发酵种子接种于玉米粉0.8%、黄豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0. 8%、碳酸钙0. 15%、硫酸镁0. 02%、消泡剂0. 005%, pH 7. 0 ；发酵条件发酵温度为、通气量为0. 2v/v/min,搅拌速度为100转/分钟，发酵时间36小时；在发酵过程中，间隔2个小时取样1次，测定pH值，观察菌落形态。在芽孢数达到5%时，添料一次，在芽孢数达到90%时，停止发酵，并通过显微镜观察确定是否为本生物制剂，并用血球计数板来统计菌体数，每毫升中含有2亿个活菌量。所得发酵液即为本发明的生物制剂。实施例3菌株活化及扩繁将菌株在LB固体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值 7. 0左右，1. 5%琼脂)上划线活化，并在LB液体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值7. 0左右)扩繁，得到发酵种子。将发酵种子接种于玉米粉0.8%、黄豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0. 8%、碳酸钙0. 15%、硫酸镁0. 01%、消泡剂0. 005%, pH 5. 5 ；发酵条件发酵温度为30°C、通气量为0. 2v/v/min，搅拌速度为100转/分钟、34小时；在发酵过程中，间隔 2个小时取样1次，测定pH值，观察菌落形态。在芽孢数达到5%时，添料一次，在芽孢数达到90%时，停止发酵，并通过显微镜观察确定是否为本生物制剂，并用血球计数板来统计菌体数，每毫升中含有2亿个活菌量。所得发酵液即为本发明的生物制剂。实施例4菌株活化及扩繁将菌株在LB固体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值 7. 0左右，1. 5%琼脂)上划线活化，并在LB液体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值7. 0左右)扩繁，得到发酵种子。将发酵种子接种于玉米粉0.8%、黄豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0. 8%、碳酸钙0. 15%、硫酸镁0. 01%、消泡剂0. 005%, pH 7. 0 ；发酵条件发酵温度为35°C、通气量为0. 4v/v/min，搅拌速度为150转/分钟、36小时；在发酵过程中，间隔 2个小时取样1次，测定pH值，观察菌落形态。在芽孢数达到5%时，添料一次，在芽孢数达到90%时，停止发酵，并通过显微镜观察确定是否为本生物制剂，并用血球计数板来统计菌体数，每毫升中含有2亿个活菌量。所得发酵液即为本发明的生物制剂。实施例5菌株活化及扩繁将菌株在LB固体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值 7. 0左右，1. 5%琼脂)上划线活化，并在LB液体培养基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化钠，pH值7. 0左右)扩繁，得到发酵种子。将发酵种子接种于玉米粉0. 5%、黄豆粉1 %、酵母粉0. 1 %、蛋白胨0. 5%、磷酸二氢钾0. 3%、碳酸钙0. 09%、硫酸镁0. 02%、消泡剂0. 005%, pH 8. 5 ；发酵条件发酵温度为35°C、通气量为0. 4v/v/min,搅拌速度为150转/分钟、36小时；在发酵过程中，间隔2个小时取样1次，测定PH值，观察菌落形态。在芽孢数达到5%时，添料一次，在芽孢数达到90%时，停止发酵，并通过显微镜观察确定是否为本生物制剂，并用血球计数板来统计菌体数，每毫升中含有2亿个活菌量。所得发酵液即为本发明的生物制剂。本发明生防制剂防治白粉病的田间防治效率实验。1.实验材料以黄瓜、烟草、草莓白粉病为实验对象，测定FBRl制备的生物制剂控制白粉病的田间效果。生物制剂中有效活菌数为至少为2X109。2.实验设计A稀释100倍，叶面喷施；B稀释300倍，叶面喷施；C稀释500倍，叶面喷施；D稀释800倍，叶面喷施；E稀释1000倍，叶面喷施；CK清水对照。每个处理喷施100棵植株，重复3次。并间隔7到9天喷施一次。3.数据统计病害分级标准0级无病斑；1级-病斑面积占叶面积的1/4以下；2级-病斑面积占叶面积的 1/4-2/4 ；3级-病斑面积占叶面积的2/4-3/4 ；4级-病斑面积占叶面积的3/4以上。病情指数=[Σ (病级值X该级发病叶数)/(调查总叶数X最高病级值)]X100防治效率的计算公式=[1_(处理的病情指数/对照的病情指数)]X 100以SPSS统计软件对数据进行分析。4.实验结果下表是对黄瓜白粉病生防效果的数据
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBRl，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4915。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) FBRl在防治农作物白粉病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述农作物为瓜类、蔬菜、烟草或者草莓。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述白粉病是由单囊壳白粉菌引起的。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。
6.一种制造如权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的工业方法，其特征在于发酵培养基为玉米粉0. 5-1. 0%、黄豆粉1. 0-1. 5 %、酵母粉0-0. 1 %、蛋白胨0. 2-0. 5 %、磷酸二氢钾0. 3-0. 8 %、碳酸钙0. 09-0. 15 %、硫酸镁0. 01-0. 02 %、消泡剂 0. 005%, PH 5. 5-8. 5，用水定容；发酵温度为 28_;35°C，通气量为 0. 2v/v/min_0. 4v/v/min， 搅拌速度为100-150转/分钟，发酵时间为24-36小时。
7.如权利要求6所述的工业方法，其特征在于所述发酵培养基中还包含蔗糖 0-2. 0%。
8.—种生防制剂，其特征是所述生防制剂含有保藏号为CGMCC No. 4915的草芽孢杆菌 FBRl。
9.根据权利要求8所述生防制剂的田间使用方法，其特征是将所述生防制剂稀释 0-1000 倍。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征是将所述生防制剂稀释300-500倍。
全文摘要
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治白粉病的生防制剂中的应用，属于微生物农药领域，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FBR1，保藏编号CGMCC No.4915；其工业发酵的培养基为玉米粉0.8％、黄豆粉1.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.5％、磷酸二氢钾0.8％、碳酸钙0.15％、硫酸镁0.02％、消泡剂0.001％、pH 7.0，用水定容；在发酵温度为28-35℃、通气量为0.2v/v/min-0.4v/v/min、搅拌速度为100-150转/分钟的条件下发酵24-36小时；本发明还公开了一种生防剂，包含所述的枯草芽孢杆菌，可以用于瓜类、蔬菜、烟草及草莓等经济作物白粉病的防治，替代了化学农药的喷洒，绿色环保，没有污染。
文档编号C12N1/20GK102250814SQ201110203240
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者熊国如, 范成明 申请人:范成明