专利名称：低温发酵的德氏保加利亚乳杆菌及用其制备酸奶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及低温条件下发酵性能良好的德氏保加利亚乳杆菌及用其制备酸奶的方法。
背景技术：
酸奶源于保加利亚，最早是一种营养丰富、易于消化的民间饮料。20世纪初，诺贝尔奖获得者俄国科学家梅契尼柯夫在研究人类长寿问题时，到保加利亚去作调查，发现每千名死者中有4名是百岁以上去世的，这些长寿者生前都爱喝酸奶，他断定喝酸奶是使人长寿的一个重要原因。经他对酸奶的研究结果证明酸奶中含有一种生长活性因子，能增强机体免疫机能，有利于身体健康，抗病、抗衰老。世界上有很多长寿的地方，居民都有长期饮酸奶的习惯。梅契尼柯夫对酸奶的研究成果使西班牙商人伊萨克·卡拉索受到启发，于是开始了酸奶生产。最初他们把酸奶当作药品在药房销售，第二次世界大战爆发后，伊萨克 卡拉索在美国建立了一家酸奶厂，并大做广告，不久酸奶风靡美国，并在世界各地流行开来。后续的研究结果证明，酸奶不仅可增强人体免疫功能，还能降低血清胆固醇的水平。有实验证明，甚至在不用任何药物的情况下，每餐饮用约240克酸奶，一周后血清胆固醇水平可以降低。另外常饮用酸奶能促进肠道运动，软化酵解结肠内容物，增加粪便排泄量，预防便秘发生，有益于预防结肠癌。因此，酸奶在国外被誉为“长寿食品”。目前各种酸奶制品品种繁多，有凝固型的、搅拌型的，不管是何种酸奶，其共同的特点都是含有乳酸菌。酸乳中的乳酸菌来源于生产时所加的发酵剂，目前生产酸奶的发酵剂中含有的乳酸菌大多为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，它样的最适宜的生长温度为40°C 左右ο生产酸奶最重要的要素就是发酵酸奶的发酵剂菌种，只有好的发酵剂菌种才能生产出优质的酸奶。酸奶发酵剂的菌种不仅影响酸奶的品质，也决定了酸奶发酵工艺参数，例如发酵温度、发酵周期等。目前，酸乳生产的工艺中发酵温度通常为42 ° C左右，此温度发酵的酸奶在贮藏过程中会出现后酸化、乳清析出及风味改变等质量问题。另外，由于酸奶发酵温度较高，会增加工厂的热能成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够低温发酵的德氏保加利亚乳杆菌。本发明的另一个目的是提供一种用德氏保加利亚乳杆菌制备酸奶的方法。本发明中的德氏乳杆菌保加利亚亚种1是从甘肃省甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳中筛选得到的，分类命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种Hactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1，于2011年4月22日在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保藏，保藏号 CGMCC NO. 4774。青藏高原牧区具有非常特殊的地理生态环境，海拔高、昼夜温差大，以牦牛乳为原料的自然酸奶长期以来是生活在该区域藏民族的主食之一。牧民采用千百年来沿袭古老而传统的方法制作酸奶，将新鲜的牦牛乳加热煮沸，冷却后接种上次制作预留的酸奶(接种量一般是3% 5%)，为防止酸奶过酸或异味，常维持较低的发酵温度，在室内放置(10 25 ° C)至凝乳，属于典型的低温发酵。在长期的自然进化过程中，传代性好、抗逆性强、凝乳状态好、风味独特、低温发酵的的优良乳酸菌得到富集。本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1的筛选方法是采集甘南藏族自治州牧民家自制发酵牦牛乳样品，取1 mL于 9 mL无菌生理盐水中稀释到10_3-10-7，吸取0. 2 mL涂布于MRS平板培养基上，25 ° C好氧培养Μ-4 !。选择革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌落进一步划线分离，直到分离得到纯菌种为止。将初筛菌株进行发酵性能试验，经过复筛得到菌株。MRS培养基组成蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g,K2HPO4 3H20 2 g，乙酸钠 5 g，葡萄糖 20 g，吐温 80 1 mL，柠檬酸二铵 2 g, MgSO4 7H20 0.58 g, MnSO4 4H20 0. 25 g, 加蒸馏水至1000 mL，调节pH 6.2-6.4。本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种1 CGMCC NO. 4774，具有在低温下发酵的能力。用本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株制备酸奶的方法，步骤如下
往4. 60 4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20 0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60 65 °C，然后在15-25MPa下均质10 20min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌 5min，然后冷却至30°C备用；向0. 04kg杀菌乳中接入本发明的德氏保加利亚乳杆菌3接种环，培养24h使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C 下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟Mh即可。本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种、Lac tobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1于2011年4月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO. 4774。本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1具有以下特性
1.培养特征
德氏乳杆菌{呆力口禾1J亚亚种{Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1 菌体为长杆状，过氧化氢试验阴性，革兰氏染色结果为阳性，菌株革兰氏染色见图1。菌株在MRS 液体培养基37°C恒温培养M h时，培养液混浊均勻，菌体下沉。2.遗传学特征(菌株16SrRNA序列)
本发明测定了该菌株的16S rRNA序列，如下，全长为1443bp。TAATACATGCAAGTCGAGCGAGCTGAATTCAAAGATCCCTTCGGGGTGATTTGTTGGACGCTAGCGGCG GATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAC AACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGCAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAG TTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGT GAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGA CGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCAT CGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAA GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGCGCTAGGTGTTGGGGACTTTCCGGTCCTCAGTGCCGCAGCAAAC GCATTAAGCGCTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTGTGCTACACCTAGAGATAGG TGGTTCCCTTCGGGGACGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAAC GAGAAGCGAACCCGCGAGGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCA CGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT CACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGTCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGCCTAA 3.发酵性能及生长性能
图2示出了本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1在MRS培养基中生长曲线图，图3示出了本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵过程中滴定酸度，图4示出了本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵过程中pH随时间变化曲线图，图5是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种冷藏期间活菌数的变化图。说明
(1)在25 ° C条件下能在小于M小时中使乳酸化至pH4. 60以下，滴定酸度达到 70° T以上。(2)在4 ° C条件下储存14天和/或21天后测量的活菌数始终高于108cfu/mL。
图1是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种的革兰氏染色菌体形态图。图2是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种在MRS培养基中生长曲线图。图3是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵过程中滴定酸度。图4是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵过程中pH随时间变化曲线图。图5是本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种冷藏期间活菌数的变化图。图6是不同菌株发酵的酸奶冷藏期间粘度变化图。图7是不同菌株发酵的酸奶冷藏期间双乙酰含量变化图。
具体实施例方式下面的实施例可以进一步说明本发明，实施例均采用德氏乳杆菌保加利亚亚种 {Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 1 CGMCC NO. 4774 作为发酵菌种。实施例1
杀菌乳制备往4. 6kg鲜乳或还原乳中加入0. 3kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60°C，然后在15MPa下均质lOmin，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至 30°C备用。酸奶制备向0.04kg杀菌乳中分别接入本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种{Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 3 环，士咅养 24h j吏细胞数在 IO8 IO9CfuAiL之间，分别取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例1 参比菌株德氏保加利亚乳杆菌LB340，为Danisco商业菌株。酸奶制备向0.04kg实施例1制备的杀菌乳中接入德氏保加利亚乳杆菌LB340 3环，培养24h使细胞数在IO8 IO9CfVmL之间，分别取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中， 在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。酸奶粘度比较 1、粘度测定方法
酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏1，2，5，7，14，21天后， 取适量酸奶放入烧杯中，用SNB-I型数字式粘度计3号转子在12 rpm条件下对样品进行测定，记录表观粘度(pa_ s)，重复这种测量三次并得到平均值。2、结果与结论
除冷藏前两天，使用德氏保加利亚乳杆菌LB340 (参比菌株)发酵的酸奶与使用本发明的菌株发酵的酸奶相比，参比菌株粘度较低(参见图6 )。实施例2
杀菌乳制备往4. 60kg鲜乳或还原乳中加入0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至65 °C，然后在25MPa下均质20min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至30°C备用。酸奶的制备向0.04kg杀菌乳中接入本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种3环，培养24h使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例2 参比菌株德氏保加利亚乳杆菌LB340，为Danisco商业菌株。酸奶制备向0. 04kg实施例2制备的杀菌乳中接入德氏保加利亚乳杆菌LB340 3环，培养24h使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C 下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。酸奶双乙酰含量比较 1、双乙酰标准曲线的绘制
(1)准确量取15 μ L双乙酰标准品，定容至500 mL。(2)取12支编号的试管分成2排放置，并加0. OmL,2. 0 mL、4. 0 mL、6. 0 mL、8. 0 mLUO.O mL的标准溶液各2支，分别用蒸馏水补足10 !^，取5.0 mL上述双乙酰标准溶液加入8 %的三氯乙酸溶液，这样的双乙酰标准溶液的浓度分别为0.0 yg/ mL、3.0 μ g/ mL、 6. O μ g/ mL、9. O μ g/ mL>12. O μ g/ mL>15. O μ g/ mL。(3)第一排试管中加入0.5 mL 1 %的邻苯二胺溶液，第二排试管不加为空白。摇勻后置于黑暗处放置30 min。(4)反应完全后加入4. O mol/L盐酸终止反应，第一排试管中加2. O mL，第二排试管中加2. 5 mL，混勻后以第二排试管空白作为参比液，在335 nm波长下用石英比色皿测定吸光度值。(5)以双乙酰浓度作为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2、供试样品中双乙酰浓度的测定
(1)酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏1，2，5，7，14，21 天后，测定其双乙酰含量。重复这种测量三次并得到平均值。( 样品处理酸奶样30 mL，加30 mL 16 %的三氯乙酸，混勻，静置10 min，4 ° C 下4500 rpm离心10 min，将上清再用滤纸过滤一遍，保证澄清。同时以无菌全脂乳作对照。(3)取待测样品，用8 %的三氯乙酸溶液稀释至适当的倍数，重复上述过程的3、 4、5步，然后查双乙酰标准曲线可获得待测样品中双乙酰浓度(yg/ mL)。3、结果与结论
使用参比的德氏保加利亚乳杆菌LB340发酵的酸奶与使用本发明菌株发酵的酸奶相比，对照例2的双乙酰含量低(参见图7)。实施例3
杀菌乳制备往4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至62 °C，然后在20MPa下均质15min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌5min，然后冷却至30°C备用。酸奶的制备向0. 04kg杀菌乳中分别接入本发明菌株3环，培养24h使细胞数在 IO8 IO9CfuAiL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C下进行培养至凝乳，然后冷却到4 °C，在0 5 °C冷库中贮存，后熟M h即可。对照例3 参比菌株德氏保加利亚乳杆菌LB340，为Danisco商业菌株。酸奶的制备向0. 04kg实施例2制备的杀菌乳中接入德氏保加利亚乳杆菌LB340 3环，培养Mh使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C 下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟M h即可。后酸化性能比较
1、菌株后酸化性能测定
发酵的酸奶在4 ° C环境冷藏24h后作为冷藏第1天，随后分别在冷藏2，5，7，14，21 天后，测定其滴定酸度。根据GB 5413. 34-2010，取IOmL酸奶样，加入20mL蒸馏水，加2-3 滴酚酞，用0. lmol/L的NaOH滴定至微红色，30s不褪色为终点，记录消耗的NaOH的体积，用 0T表示，重复这种测量三次并得到平均值。2、结果与结论
使用对照例3德氏保加利亚乳杆菌LB340 (参比菌株)发酵的酸奶与使用本发明菌株发酵的酸奶相比，参比菌株后酸化能力稍弱(参见表1)。表1不同菌株发酵的酸奶冷藏期间滴定酸度的变化
权利要求
1.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种1 CGMCC NO. 4774，具有在低温下发酵的能力。
2.如权利要求1所述的菌株制备酸奶的方法，其特征在于步骤如下往4. 60 4. 80kg鲜乳或还原乳中加入0. 20 0. 40kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60 65 °C，然后在15-25MPa下均质10 20min，得到的均勻液体再于95°C下杀菌 5min，然后冷却至30°C备用；向0. 04kg杀菌乳中接入本发明的德氏保加利亚乳杆菌3接种环，培养24h使细胞数在IO8 109Cfu/mL之间，取0. 03kg接种于备用的杀菌乳中，在25°C 下进行培养至凝乳，然后冷却到4°C，在0 5°C冷库中贮存，后熟Mh即可。
全文摘要
本发明公开了一种低温发酵的德氏保加利亚乳杆菌及用其制备酸奶的方法，本发明菌种是采用MRS培养基从甘肃省甘南自治州的发酵牦牛乳中分离得到的。该菌株在25℃下发酵15h即可凝乳，用该菌株生产的酸奶具有粘度高、双乙酰含量高的特点。
文档编号A23C9/123GK102286407SQ20111022098
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者乔海军, 张卫兵, 张炎, 梁琪, 甘伯中, 米兰 申请人:甘肃农业大学