专利名称：含有β-1,3-D-葡聚糖的提取物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用定向控制酶解技术获得的提取物，尤其涉及一种利用β -1，3 葡聚糖苷酶，对绣球菌中所含有的葡聚糖进行部分水解后而获得的含有β -1，3-D-葡聚糖的提取物，及其在抗肿瘤、免疫调节及辅助治疗糖尿病、心脑血管疾病等方面的应用。
背景技术：
绣球菌(Sparassis crispa(ffulf. )Fr.)，又名绣球菇，绣球蕈，花椰菜菇，花瓣茸， 是一种珍稀名贵的食用菌。绣球菌在分类上属无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)、 无裙菌巨(Aphyllophorales)、绣球菌禾斗(Sparassidaceae)、绣球菌属(Sparassis crispa Fr.)。绣球菌品种很多，从目前调查发现，绣球菌科至少有7个属，在我国野生绣球菌品种大约有10多个品种，由于产地不同，气候条件不一样，各品种的颜色、外观和营养成分各有差异。它在食用菌中，其价值仅次于冬虫夏草、羊肚菌和块菌等珍品。绣球菌子实体一年生，初肉质，后期稍带韧性，老时脆硬，近白色或浅黄色，从粗短的柄上多次分支，直立，末端枝扁平，花瓣状酷似银杏叶相互交错、扭曲、密集成丛，很像绣球花，故而得名。直径15-30cm 或更大，最大的超过20kg。绣球菌一般生于夏秋季松树等针叶林中的地上，生长季节为 7-10月，着生于树干基部的腐朽树根或树桩上，绝大部分生长在地上，喜欢温差刺激、喜欢阳光，生长速度比较缓慢，成熟期较长。绣球菌分布在黑龙江、吉林、河北、云南、陕西、四川、 甘肃、西藏、广东、福建等省，海拔一般在2500-3700m范围生长。绣球菌原为野生珍稀药食用菌，20世纪90年代在日本首获栽培成功，并进入商业性生产，韩国为绣球菌人工栽培成功的第2个国家，国内学者经过20多年的研究，也获人工栽培成功，成为第3个人工栽培成功的国家。绣球菌的主要化学成分为葡聚糖，这也是其主要活性成分。一般绣球菌中葡聚糖的含量可达到40%以上，高的甚至可达到50%，其结构大多为β-1，6糖苷键分支的 β -1，3-D-葡聚糖，绣球菌中的葡聚糖70%以上是β -1，3-D-葡聚糖，可以说是菇类之最。因绣球菌中 β-1，3-D-葡聚糖功效卓越(Food Rev. Int. , 1995，11，7-12 ；Cancer Research, 2003, 63, 9023-9031 ；Food Funct. , 2010, 1， 149-55 ；Medicina (Kaunas). 2007，43，597-606 ；doi:10. 3109/09637486. 2011. 566849)，价格昂贵，被誉为“免疫金牌”。近年来，研究发现，绣球菌具有以下生理活性
1.抗肿瘤活性
绣球菌中β-1，3-D-葡聚糖会活化多种免疫细胞如刺激巨噬细胞、T细胞、B细胞以及自然杀手细胞等，以达到抑制肿瘤生长和阻止癌细胞转移的效果，从而提高肿瘤患者的生存率，延长生存期，改善症状和提高生活质量。绣球菌中β-1，3-D-葡聚糖还会引发补体的活化反应，显著提升靶向治疗药物的治疗效果。2.降血糖作用
绣球菌中β-1，3-D-葡聚糖具有β-1-3-葡聚糖的结构主链及β-1-6-葡聚糖结合的支链，具有降血糖的功效。
3.降胆固醇作用
绣球菌中β-1，3-D-葡聚糖，抑制肠管膜吸收胆固醇及其衍生物，从而具有降低胆固醇的作用。4.嫩肤、祛斑和美白作用
绣球菌能促进胶原蛋白的产生，从而起到嫩肤、祛斑和美白作用。5.提高造血和提高免疫力的作用
绣球菌可以提高机体的造血功能，从而提高机体的免疫力，减少化疗带来的毒副反应， 提高化疗的治疗效果。除此之外，绣球菌还具有激活白细胞和相关免疫系统的作用，从而起到抗疲劳和延缓衰老的作用。6.抗发炎作用
绣球菌中β -1，3-D-葡聚糖，具有非特异性免疫增强活性，已获得证实具有抗炎作用与抗过敏反应作用。7.抗血栓作用
绣球菌中含有抗血栓物质，可避免高血压患者所引起的脑血管阻塞、冠状血管血栓及发生动脉硬化等作用。Ohno通过化学、酶和NMR分析发现这种葡聚糖每隔三个单元就有一个分支。葡聚糖的生物活性与葡聚糖的化学结构、构象、分子量和物理性质有关。β -1，6糖苷键分支的 β-1，3-D-葡聚糖活性最强，β-1，6主链的D葡聚糖基本没有活性。葡聚糖在溶液中，根据溶液环境，以随机卷曲结构，单螺旋结构或三股螺旋结构存在，三股螺旋结构最稳定，活性也最强，其他两种结构会向三股螺旋结构的稳定结构转化。葡聚糖进入人体后，只被部分水解为小分子，在小肠里被迅速吸收，再被转移到组织器官，然后被从体内清除。经过二十多年的研究，日本的Mizimo和他的合作者开发出一套可靠的从食用菌子实体或者菌丝体中提取、分离和纯化多糖的方法，先用80%的乙醇除去低分子量杂质，再依次连续用沸水提取3小时，2%草酸铵80°C提取6小时和5%氢氧化钠80°C提取6小时。 第一道提取出水溶性多糖，其他两道提取出水不溶性多糖。这些多糖再用乙醇分级沉淀法、 酸沉淀法、离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等方法进行分离纯化。一般，DEAE离子交换色谱将中性多糖从酸性多糖中分离出来。中性多糖再用凝胶色谱和亲和色谱分为吸附的 α-葡聚糖和不吸附的β-葡聚糖，酸性多糖采用相同的步骤，用IM NaCl洗脱，得到纯化多糖。此方法是目前食用菌多糖提取所采用的通用方法，利用此步骤提取纯化多糖，可以把不同溶解性的多糖分离，把中性和酸性多糖分离，再进而把多糖分离成α-葡聚糖和β-葡聚糖，利用凝胶色谱，也可以分离出不同分子量的葡聚糖，但步骤较繁琐，对于葡聚糖中糖苷键的连接方式，如1，4、1，3和1，6连接不能有效区分。Naohito Ohno公开的提取绣球菌中多糖的方法为先用乙醇4°C脱脂2天，再用水高压121°C提取2小时，提取出的多糖再用1倍体积和4倍体积的乙醇沉淀，残渣用 10% NaOH/5%尿素，在4°C提取2天，提取液充分透析后，干燥。干燥物用8M尿素溶解，用 DEAE Sephedex A25(C12)分离，洗脱液充分透析后冷冻干燥，得到绣球菌多糖，多糖纯度为 73.6%。此方法得到的绣球菌多糖为α-葡聚糖和葡聚糖的混合物，且分子量较大，通常与天然多糖的分子量一致。中国发明专利申请200610108522. 9公开了一种绣球菌ΜΗ-3菌株的提取物及其制备方法和用途，该申请对绣球菌的子实体分别用热水、冷碱水和热碱水进行提取后，得到绣球菌β -1，3葡聚糖，但其纯度较低，分子量也较大，在200万左右。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，采用定向控制酶解技术对绣球菌中所含有的葡聚糖进行部分水解后而获得的含有β -1，3-D-葡聚糖的提取物。本发明的另一个目的在于提供一种含有β -1，3-D-葡聚糖的提取物，在抗肿瘤、 免疫调节和提高造血功能等方面的应用。本发明提供的一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，采用如下提取方法在条件下，采用β -1，3葡聚糖苷酶，对绣球菌水解3小时，使其中所含有的葡聚糖部
分水解而得。本发明的绣球菌为绣球菌子实体，或将绣球菌子实体切割后的子实体块、或将绣球菌子实体经研磨而成的粉末。为使提取物更好的发挥其生理活性，如但不仅限于，抗肿瘤活性、降血糖作用、降胆固醇作用、嫩肤、祛斑和美白作用、提高造血和提高免疫力的作用、抗发炎作用和抗血栓作用等，本发明优先选择含有的β-1，3-D-葡聚糖分子量为20 万-50万道尔顿的提取物。为达到此目的，本发明提取方法所用的绣球菌优先选择平均粒径小于60-80目的绣球菌子实体粉末。本发明的β -1，3葡聚糖苷酶，其加入量按每毫升起始酶解液中加入2单位的酶计
笪弁。另一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，采用如下提取方法将绣球菌粉碎成 60-80目的粉末，然后加入绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料， 于121°C灭菌30分钟，之后将浆状物料的温度冷却至；接着加入β -1，3葡聚糖苷酶(β -1，3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升浆状物料加入2单位的酶计算)，于间隙搅拌保温水解3小时，最后将水解产物于40-50°C真空干燥，控制水分达到12%以下即得提取物。所得提取物中含有30%-45%的分子量为20万-50万道尔顿的β -1，3-D-葡聚糖。采用一种或几种分离纯化技术对β -1，3葡聚糖苷酶酶解所得的水解产物进行进一步纯化，以提高其中的β-1，3-D-葡聚糖含量。这些分离纯化的方法如但不仅限于，沉淀法、水提法和凝胶过滤法等。另一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，采用如下提取方法将绣球菌粉碎成 60-80目的粉末，然后加入绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料，于 121°C灭菌30分钟，之后将浆状物料的温度冷却至；接着加入β -1，3葡聚糖苷酶 (β-1,3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升浆状物料加入2单位的酶计算)，于间隙搅拌保温水解3小时，得水解产物；向水解产物加入绣球菌7倍重量的水，煮沸提取2-3小时， 过滤，所得滤渣再加入绣球菌10倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤后，合并滤液；将合并滤液浓缩至总体积的1/4-1/5后，加入乙醇，直至乙醇浓度达到65v/v%-75v/v%，静置沉淀 2-3小时，离心并收集上清液，再向上清液中加入乙醇，直至乙醇浓度达到85v/v%-90v/v%， 静置沉淀2-3小时，离心并收集沉淀，沉淀再用85v/v%-90v/v%的乙醇洗涤两次，干燥即得提取物，提取物中含有50%-65%的分子量为20万-50万道尔顿的β -1，3-D-葡聚糖。
另一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，将绣球菌粉碎成60-80目的粉末，然后加入绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料，于121°C灭菌30分钟，之后将浆状物料的温度冷却至；接着加入β -1，3葡聚糖苷酶(β -1，3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升浆状物料加入2单位的酶计算)，于间隙搅拌保温水解3小时，得水解产物；向水解产物加入绣球菌7倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤，所得滤渣再加入绣球菌10倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤后，合并滤液；将合并滤液浓缩至于总体积的 1/4-1/5后，加入乙醇，直至乙醇浓度达到65v/v%-75v/v%，静置沉淀2_3小时，离心并收集上清液，再向上清液中加入乙醇，直至乙醇浓度达到85v/v%-90v/v%，静置沉淀2-3小时，离心并收集沉淀，沉淀再用85v/v%-90v/v%的乙醇洗涤两次，所得产物再依次经凝胶层析、浓缩、透析和乙醇沉淀后，干燥即得提取物。提取物中含有70%-80%的分子量为20万-50万道尔顿的β-1，3-D-葡聚糖。制得的本发明提取物具有显著的抑制肿瘤作用，不但能促进人体新陈代谢，还有防癌抗癌、延年益寿和增强免疫的功能，用于制成各种功能性保健食品或药物，以起到调节血糖，辅助治疗糖尿病、降低血脂和胆固醇，改善心脑血管疾病和嫩肤、祛斑、美白作用，还有抗疲劳、延缓衰老和抗感染、抗过敏等作用。本发明技术方案实现的有益效果
本发明提供的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，利用β-1，3葡聚糖苷酶，使绣球菌中所含有的葡聚糖部分水解而得，再综合运用一种或几种分离纯化技术提高了水解产物中所含的β-1，3-D-葡聚糖。经动物试验表明，采用本发明制得的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，对S-180所致的荷瘤小鼠具有显著的抑瘤作用，故本发明制得的提取物具有显著的抑制肿瘤、防癌抗癌作用。可用于制成各种功能性保健食品或药物。
具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛一奥德里奇(Sigma — Aldrich)。实施例1
将IOkg干绣球菌粉碎到80目，加入200L的高压反应釜中，加入50kg磷酸缓冲液(pH 值为7. 3，具体配制为磷酸氢二钠1. 97 g与磷酸二氢钾0. 22 g，加水使溶解成1000 mL, 调节PH值至7. 3)，搅拌均勻，温度加热到121°C，保温30分钟，对物料进行灭菌处理，然后快速将物料冷却到30°C，加入IOOg β-1，3葡聚糖苷酶，搅拌均勻，水解3小时，将大分子β-1，3葡聚糖水解成特定分子量大小的β-1，3葡聚糖，将水解浆状物45°C真空干燥，控制水分达到12%以下，即得提取物，其中含有45%的分子量为20万-50万道尔顿的 β -1，3-D-葡聚糖。将提取物超低温粉碎成180目的超细粉，记为ΚΑ-231。实施例2
将IOkg干绣球菌粉碎到80目，加入到200L的高压反应釜中，加入50kg磷酸缓冲液(pH值为7. 3，具体配制为磷酸氢二钠1.97 g与磷酸二氢钾0.22 g，加水使溶解成1000 mL, 调节PH值至7. 3)，搅拌均勻，温度加热到121°C，保温30分钟，对物料进行灭菌处理，然后快速将物料冷却到30°C，加入IOOg β -1，3葡聚糖苷酶，搅拌均勻，水解3小时，将大分子 β -1，3葡聚糖水解成特定分子量大小的β -1，3葡聚糖，再加入70kg水，煮沸提取2小时， 过滤，滤渣再加入IOOkg水，煮沸提取2小时，过滤。合并的滤液于70°C真空浓缩至50kg， 加入乙醇，直至乙醇浓度达到65% (ν/ν)，搅拌均勻，静置2小时，3，OOOrpm离心5分钟，弃去沉淀，往上清液中继续加入乙醇，直至乙醇浓度达到90% (ν/ν)，搅拌均勻，静置2小时， 5，OOOrpm离心5分钟，收集沉淀，并用90% (ν/ν)乙醇离心洗涤两次，即得提取物，其中含有65%的分子量为20万-50万道尔顿的β -1，3-D-葡聚糖。干燥提取物得2. 32 kg,记为 KA-232。实施例3
采用kphadex G-100凝胶层析分离纯化实施例2得到的KA-232，洗脱液为0. IM NaCl 溶液，用苯酚+硫酸法监测洗脱峰，合并单一峰部分，依次经浓缩、透析和乙醇沉淀，即得提取物，其中含有80%的分子量为20万-50万道尔顿的i3-l，3-D-葡聚糖。经自然干燥，得到白色或灰白色粉末，记为KA-233。实施例4
选用5个已知分子量的多糖标准品(Putus Macromolecular Sci. & Tech. Ltd的标准品，分子量大小为，20万、30万、40万、50万和100万)，分别用流动相溶解制成每ImL中约含10 mg的溶液，分别注入25 μ L标准品溶液，记录示差色谱图。由GPC专用软件绘制标准曲线。线性回归方程为logM = a + bRT。对实施例3制得的KA-233分子量进行测定，β _1，3葡聚糖的的重均分子量(Mw) 均落在25-50万道尔顿范围内。实施例5
选用体重18 22 g的BALB/C小鼠，无菌条件下取BALB/C小鼠皮下移植S-180实体瘤10 15天后瘤组织，勻浆后以无菌生理盐水1 5稀释，计数后，无菌条件下小鼠腋窝皮下接种，0. 2mL/只，浓度2 4 X 107/ml。阳性对照组CTX (50mg/kg,每隔2天腹腔注射1次)，在第14天对试验组小鼠喂 lOOmg，200mg和 500mg KA-231，10mg，50mg 和 75mg KA-232，10mg，50mg 和 75mg KA-233，然后在第35天观察肿瘤生长情况，末次给药后次日处死动物，称瘤重。结果见表1。表 权利要求
1.一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于采用如下提取方法在条件下，采用β -1，3葡聚糖苷酶，对绣球菌水解3小时，使其中所含有的葡聚糖部分水解而得。
2.根据权利要求1所述的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于所述绣球菌为平均粒径小于60-80目的绣球菌子实体粉末。
3.一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于采用如下提取方法将绣球菌粉碎成60-80目的粉末，然后加入所述绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料，于121°C灭菌30分钟，之后将所述浆状物料的温度冷却至 28-300C ；接着加入β_1，3葡聚糖苷酶，于观-301间隙搅拌保温水解3小时，最后将水解产物于40-50°C真空干燥，控制水分达到12%以下即得所述提取物；所述β -1，3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升所述浆状物料加入2单位的酶计算。
4.根据权利要求3所述的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于所述提取物中含有30%-45%的β -1，3-D-葡聚糖。
5.一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于采用如下提取方法将绣球菌粉碎成60-80目的粉末，然后加入所述绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料，于121°C灭菌30分钟，之后将所述浆状物料的温度冷却至接着加入β-1，3葡聚糖苷酶，于28-30°C间隙搅拌保温水解3小时，得水解产物； 向所述水解产物加入绣球菌7倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤，所得滤渣再加入所述绣球菌10倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤后，合并滤液；将所述合并滤液浓缩至总体积的1/4-1/5后，加入乙醇，直至乙醇浓度达到65v/v%-75v/v%，静置沉淀2_3小时，离心并收集上清液，再向上清液中加入乙醇，直至乙醇浓度达到85v/v%-90v/v%，静置沉淀2-3 小时，离心并收集沉淀，所述沉淀再用85v/v%-90v/v%的乙醇洗涤两次，干燥即得所述提取物；所述β -1，3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升所述浆状物料加入2单位的酶计算。
6.根据权利要求5所述的含有离子液体的催化组合物，其特征在于所述提取物中含有 50%-65% 的 β -1，3-D-葡聚糖。
7.一种含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于采用如下提取方法将绣球菌粉碎成60-80目的粉末，然后加入所述绣球菌5倍重量的ρΗ7. 3的磷酸缓冲液，搅拌调制成浆状物料，于121°C灭菌30分钟，之后将所述浆状物料的温度冷却至 28-300C ；接着加入β -1，3葡聚糖苷酶，于间歇搅拌保温水解3小时，得水解产物； 向所述水解产物加入绣球菌7倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤，所得滤渣再加入所述绣球菌10倍重量的水，煮沸提取2-3小时，过滤后，合并滤液；将所述合并滤液浓缩至总体积的1/4-1/5后，加入乙醇，直至乙醇浓度达到65v/v%-75v/v%，静置沉淀2_3小时，离心并收集上清液，再向上清液中加入乙醇，直至乙醇浓度达到85v/v%-90v/v%，静置沉淀2-3小时，离心并收集沉淀，所述沉淀再用85v/v%-90v/v%的乙醇洗涤两次，再依次经凝胶层析、 浓缩、透析和乙醇沉淀后，干燥即得所述提取物；所述β -1，3葡聚糖苷酶的加入量按每毫升所述浆状物料加入2单位的酶计算。
8.根据权利要求7所述的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于所述提取物中含有80%-90%的β -1，3-D-葡聚糖。
9.根据权利要求1、3、5或7所述的含有β-1，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于所述 β -1，3-D-葡聚糖的分子量为20万-50万道尔顿。
10.根据权利要求1、3、5或7所述的含有i3-l，3-D-葡聚糖的提取物，其特征在于所述提取物用于制成各种功能性保健食品或药物。
全文摘要
一种含有β-1,3-D-葡聚糖的提取物，在28-30℃条件下，采用β-1,3葡聚糖苷酶，对绣球菌水解3小时，使其中所含有的葡聚糖部分水解而得，所含的β-1,3-D-葡聚糖的分子量为20万-50万道尔顿。本发明制得的提取物具有显著抑制肿瘤、防癌抗癌功能，能调节血糖、辅助治疗糖尿病，降低血脂和胆固醇、改善心脑血管疾病，具有抗疲劳、延缓衰老、抗感染、抗过敏及嫩肤、祛斑、美白的作用，可用于制成各种功能性保健食品或药物。
文档编号C12R1/645GK102277400SQ20111023260
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者叶甫云, 吕正兵, 董淮海 申请人:上海科爱生物技术有限公司