专利名称：一种siRNA输送载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种SiRNA输送载体及其在制备癌症的基因治疗药物中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的在生物界普遍存在的一种古老的生物学现象，是生物进化的产物。具体是指由双链RNA (double strand RNA, dsRNA)指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象，即不表达。目前研究表明，RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现。RNAi不仅参与了细胞正常的生长、发育、衰老和凋亡的调控，还可使外源基因导入时或病毒入侵后基因不被表达，从而成为生物体的一种有效的特异性自我防御机制。RNA干扰能特异而有效的阻断靶基因的表达外源性或内源性dsRNA，在细胞内导致与其序列同源的分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达。dsRNA引起RNA干扰的过程为核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的siRNA，大小约21-2;3bp。siRNA具有一些特征性结构即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5'端磷酸和3'端羟基。此外，每条单链的3'端均有2-3个突出的非配对的碱基，这种结构形式对siRNA进入蛋白复合体是必须的。siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义链再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。携带反义链的的 RISC 与 mRNA 的互补序列特异性结合并切割mRNA。被切割后断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞内特定 mRNA的降解反应。RNAi具有普遍、高效、特异、操作简单等突出优点，目前该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。胃癌的发生是一个多步骤多阶段的过程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。还有凋亡相关基因的异常表达、部分自分泌生长因子和受体的过量表达也与细胞癌变有密切关系。研究发现，多个分子标志物与胃癌转移潜能相关，其中研究较为深入的包括CD44异构体6 (CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一个包含20个外显子的基因编码，其中10个外显子是组成型外显子，另外10个外显子可选择性拼接而被称为变异外显子(variant exon, vl-vl0)。仅含有组成型外显子称为CD44标准体(CD44 standard form，CD44s)，而含有变异外显子则为 CD44 异构体(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s 广泛存在于在正常组织和癌组织中，而CD44v主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中。CD44v胞内区域与下游因子的选择性相互作用在协调细胞内信号通路起着重要作用，如Mio/Ras、酪氨酸激酶途径等，并与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭作用密切相关。CD44v6是目前研究较为广泛的异构体，被认为是上皮起源恶性肿瘤，包括肝细胞癌，乳腺癌，结直肠癌和胃癌发生转移的分子标志物，尤其是胃癌发生转移相对特异的分子标志物，制备抗CD44v6单链抗体用于进展期胃癌的生物治疗，可以封闭性结合胃癌组织表达的
3CD44v6,阻断其与细胞外间质或基底膜的正常连接及其所促进的肿瘤细胞浸润转移，延缓肿瘤进展；破坏CD44v6蛋白在肿瘤细胞表面形成的糖蛋白伪装，有利于免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀灭，抑制肿瘤的淋巴转移。采用RNAi技术可特异地抑制相关基因的表达，使这些基因呈现沉默或休眠状态.从而达到肿瘤治疗的目的。与传统的基因治疗的方法相比，RNAi能够实现同一基因家族的多个基因同时敲除，且抑制效果互不干扰，因为其特有的优势成为基因治疗的新策略。siRNA给药载体的研究和开发一直是困扰各国科学家的关键问题。人们一直在研究合适的载体材料能有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞和部位，并在一段合理时间维持其功效。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。另外，基于高分子的纳米颗粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究，取得了不菲成绩，其中很多成果已经用于临床或临床试验。高分子纳米颗粒的传递体系生物相容性好，具有靶向传递的潜能，具有更好的稳定性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有EI3R效应(Enhanced permeability and retention)，可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器，因此高分子纳米粒是极具潜能的siRNA传递系统的候选者。而具有良好生物相容性的可降解高分子载体，特别是具有快速去质子化能力的可降解阳离子型高分子载体能有效结合和保护siRNA分子，又能使siRNA在细胞质中迅速释放，实现阻断基因表达的目的，这将使这类载体在siRNA给药中具有更好的优势和应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种siRNA输送载体，具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体。一方面，本发明提供了一种siRNA输送载体，其活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。优选地，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。其中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40_60kD之间，优选控制在50_60kD之间， 最优为55KD ；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40_50kD之间，更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。例如在本发明的实施例1中，即是选择2kD的单甲基醚聚乙二醇与25kD枝化聚乙烯亚胺以10 1的摩尔比合成聚乙二醇-聚乙烯亚胺；而后再与55kD的超顺磁性氧化铁纳米粒子以偶联形成的本发明的siRNA输送载体，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55%。而且结合本发明实施例中的实验结果表明，采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分，能够使本发明的 siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为60_80nm，表面zeta电位为30_40mV。本发明实施例中纳米颗粒的平均粒径优选为67. 3士2. Onm，表面zeta电位优选为34. 38士 1. 66mV。从分子结构上分析，本发明提供的siRNA输送载体含有由超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。其中，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine， PEI)是一种广泛采用的高分子纳米载体，是一种水溶性的高分子聚合物，具有一级、二级和三级胺，胺基基团所带的阳性电荷和核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力，形成稳定的PEI/核酸复合物。此外，PEI突出的优势在于结构灵活，易调整其分子量，可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨架，进而调整和改善载体的性能，其体积比脂质体小，易于通过血管内皮间隙。然而，PEI和PEI/核酸复合物有较大的细胞毒性，而本发明的siRNA输送载体中，通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修饰，构成PEG-g-PEI能够降低细胞毒性且保证PEI的基因转染效率。需要说明的是，本发明siRNA输送载体用到的PEG是一种常用药用辅料，具有良好的水溶性，其分子量当控制在200-35，OOODa之间。而超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPI ON)是一禾中高效的磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)造影剂，本发明的siRNA输送载体通过将SPION与PEG-g-PEI偶联形成 PEG-g-PEI-SPI0N (PPS)，同时具备基因输送和MRI成像功能，通过MRI这一非侵入性成像技术能够及早地发现肿瘤并更准确地观察、分析治疗效果。本发明的siRNA输送载体具有良好的生物相容性和可降解性，其在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，同时拥有良好的siRNA复合能力，低细胞毒性和高转染率，作为载体能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，是一种安全、高效、优良的siRNA输送载体。另一方面，本发明还提供了一种真核细胞转染液，所述转染液包括siRNA和上述方案中揭示的siRNA输送载体，所述siRNA被吸附于siRNA输送载体形成复合物。其中，其中，复合物的N/P比值计算公式为
PPS (Mg) X45%
N/P 比值=4.2 X -^TT----
siRNA (μ )优选地，所述复合物的Ν/Ρ比值控制在5-20之间。在合适的Ν/Ρ比值情况下，纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。另外，siRNA输送载体与siRNA形成复合物后，整个复合物的平均粒径表面zeta电位会随N/P比值变化而发生变化。本发明中复合物的平均粒径控制在SO-IOOnm之间。而表面zeta电位随N/P比值的变化差异范围很大，而且在N/P比值较小时，表面zeta电位随 N/P比值的变化非常明显。另一方面，本发明还提供了一种向细胞输送siRNA的方法，该方法包括将siRNA与如权利要求1-4中任意一项所述的siRNA输送载体制备成复合物，而后根据复合物粒径、表面电位、siRNA复合能力、细胞毒性和转染率确定合适的N/P比值，再用具有合适的N/P比值的复合物向细胞中转染siRNA。优选地，SiRNA为siCD44v6，所述siCD44v6具有如下序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3‘ <SEQ ID Ν0· 1>，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5‘ <SEQ ID Ν0· 2>，
所述输送载体与si⑶44v6形成复合物，将复合物的N/P比值控制在5_15之间，向胃癌细胞转染si⑶44v6。其中，所述胃癌细胞优选为SGC-7901细胞。在本发明的具体实施例中采用PEG-g-PEI-SPION(PPS)输送针对CD44v6基因的 siCD44v6，并和Lipofectamine比较沉默CD44v6在SGC-7901细胞的表达，证明了纳米颗粒能够将siRNA运输到细胞内并发挥沉默基因表达的作用。本发明利用针对Luciferase 蛋白的siRNA进一步定量分析检验了纳米颖粒输送siRNA的能力，PEG-g-PEI-SPION(PPS) 纳米颗粒转染siRNA与Lipofectamine转染siRNA后，比较⑶44v6基因的沉默效率，采用 PEG-g-PEI-SPION(PPS)纳米颗粒转染siRNA使CD44v6基因具有更高的沉默效率，而且该结果得到T^festern blot试验进一步验证。将上述向细胞输送siRNA的方法运用到癌症的治疗中，能够降低癌细胞迁移和侵袭能力。在本发明的实施例中，用PEG-g-PEI-SPION (PPS)输送针对CD44v6基因的 si⑶44v6，通过迁移和侵袭试验观察沉默⑶44v6对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响， 实验结构表明CD44v6与对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力密切相关，而且PPS/siCD44v6复合物能够有效地抑制SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力。另外，本发明还公开所述的siRNA输送载体和真核细胞转染液在制备癌症基因治疗药物中的应用，尤其是在制备胃癌基因治疗药物中的应用。本发明通过细胞毒性实验证明本发明的siRNA输送载体具有良好的生物相容性，同时具有很好的稳定性和方便制备等特点，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。
图1是PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物凝胶阻滞电泳图。其中1 裸siRNA ；2-6 N/P 比值=1，2，3，4，5 和 10。图2是PEG-g-PEI-SPION/siRNA细胞毒性试验结果图。采用MTT法测定N/P = 1. 25，5，10和20PEG-g-PEI-SPI0N/siRNA复合物对SGC-7901细胞的毒性作用，绘制成细胞
存活率曲线。图 3 是图 10PEG-g-PEI-SPI0N 转染率实验结果图。PEG-g-PE I-SPI ON/ s i NC-Cy 3 按 N/P = 3，5和10转染SGC-7901细胞，并以lipofectamine/siNC_Cy3为对照组，流式细胞仪检测转染率。图 4 是 PEG-g-PEI-SPION/siRNA 复合物细胞内分布图。PEG-g-PEI-SPION/ siNC-Cy3复合物转染SGC-7901细胞后，荧光显微镜下拍照，可见红色荧光出现在细胞内。 普鲁士蓝染色后可见细胞胞浆出现蓝色颗粒。图5A是CD44v6沉默效应实验结果图一。siCD44v6分别通过PEG-g-PEI-SPION和 Iipofectamine转染至SGC-7901细胞，通过qRT-PCR反应其基因沉默效应的实验结果图。图5B是CD44v6沉默效应实验结果图二。siCD44v6分别通过PEG-g-PEI-SPION和 Iipofectamine转染至SGC-7901细胞。通过^festern blot反应其基因沉默效应的实验结果图。图6A是迁移实验结果示意图一。图6B是迁移实验结果示意图二。图6C是侵袭实验结果示意图一。
图6D是侵袭实验结果示意图二。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。本发明的以下实施方式中，通过研究SiRNA输送载体 PEG-g-PEI-SPION(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles, PEG-g-PEI-SPION,简禾尔 PPS)作为 siRNA 输送载体的理化性质，确定合适N/P比值。并以PPS向胃癌细胞输送靶向⑶44v6基因的 siRNA(sira44v6)为例，通过检测si⑶44v6所介导的基因沉默和生物学效应，确定本发明的siRNA输送载体PPS的作用和效果，以及其在制备基因治疗药物尤其是癌症治疗药物中的应用。下列实施例中，采用的生物材料及其来源为1、细胞株人胃腺癌细胞株SGC-7901购买自上海生物化学与细胞研究所。人胃正常上皮细胞株GES-I购买于北京肿瘤研究所。人恶性黑色素瘤细胞株A375由上海肿瘤研究所惠赠。2、主要试剂高糖DMEM培养基胎牛血清青、链霉素胰蛋白酶 PBS缓冲液 PEG-g-PEI-SPION
Lipofectamine 2000 siCD44v6、siNC、siNC-Cy3
亚铁氰化钾
CD44v6、β-actin 引物
6 χ DNA上样缓冲液
胶体金溶液
MTT
DMSO
TRIZOL
GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司 GIBCO公司
中山大学化学与工程学院合成
Invitrogen 公司
广州锐博公司设计合成广州化学制药厂宝生物工程(大连)有限公司合成
广州威佳公司中山二院中心实验室 Sigma公司广州威佳公司 Invitrogen 公司焦碳酸ニ乙酯(DEPC )广州威佳公司；
异丙醇广州化学制药厂
氯仿广州化学制药厂
PrimeScript RT试剂盒宝生物工程(大连)有限公司
SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司
RIPA裂解液上海碧云天公司
PMSF上海碧云天公司
BCA-IOO蛋白定量试剂盒上海申能博彩公司
予员染t田 markerFermentas 公ロJ
ECL化学发光液晶美生物工程公司
小鼠抗人CD44v6单克隆抗体Bender公司
小鼠抗人(3 -actin单克隆抗体Sigma公司
HRP标记山羊抗小鼠抗体Jackson公司
Cultrex Basement Membrane Extract R&D 公司
(BME)
结晶紫上海国药集团化学试剂公司3、序列(l)siCD44v6 序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3‘ <SEQ ID NO. 1>，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5‘ <SEQ ID NO. 2>，(2)CD44v6 引物序列forward primer 5' -GCA CAA TCC AGG CAA CTC C_3' <SEQ ID NO. 3>，reverse primer 5' -GCT GTC CCT GTT GTC GAA TG-3' <SEQ ID NO. 4>,(3) β-actin 引物序列forward primer 5' -TGG CAC CCA GCA CAA TGAA-3' <SEQ ID NO. 5>,reverse primer 5' -CTAAGTCAT AGTCCGCCT AGAAGC A~3' <SEQ ID NO. 6>实施例1、PPS纳米颗粒的制备1、聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI)的合成。称取4. Og单甲基醚聚乙二醇(mPEG-0H，2kD)于干燥两口瓶中60°C真空干燥8h， 冷却后Ar保护下加入30mL已干燥的四氢呋喃(THF)，充分溶解。称取N，N，-羧基二咪唑 (⑶I) 3. 2g置于另一干燥两口瓶中，Ar保护下将溶有mPEG-OH的THF溶液缓慢滴加到两口瓶中，室温下继续搅拌反应12h。加入200 μ L水使过量的⑶I失活，反应进行0.证，用大量无水乙醚沉淀2次，过滤后干燥得白色粉末状固体。再称取支化聚乙烯亚胺(hy-PEI，25kD) 1. Ig和上述白色粉末0. 8g共溶于20mL CHCl3,室温下继续搅拌反应Mh。而后通过再生纤维透析除去CHCl3,部分溶质在常压下挥发，将浓缩后的溶液用大量无水乙醚沉淀3次，收集沉淀物干燥得白色粉末状固体，产率为80%。对产物进行核磁共振分析(H-NMR)，其结果为A-NMR in CDCl3 :2. 5-2. 9ppm(m, -CH2CH2NH-)，3. 4ppm(s, CH3-OCH2CH2-)，3. 65ppm(s, -OCH2CH2-)， 4. 2ppm(t, -OCH2CH2-O(C = 0)) 0与理论值相符，从而表明Pi7G成功接枝于PEI分子链中。2、PPS 的制备。将300mg mPEG-g-PEI溶解于3ml氯仿中，而后使15mg超顺磁性氧化铁纳米粒子 (SPION, 55kD)均勻分散于该溶液中，室温下继续搅拌过夜。而后加入大量正己烷沉淀，离心收集沉淀物，用正己烷洗涤2次，而后进行真空干燥除去有机溶剂。将上述得到的产物通过超声波均勻溶解于双蒸水，并通过200nm超滤膜除去大的凝聚颗粒。需要说明的是，实施例1仅仅是本发明中制备PPS的一种实现方式，其中采用的单甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)和二支化聚乙烯业胺(hy-PEI，25kD)均购自Sigma公司， 而超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPI0N，55kD)由中山大学化学与工程学院合成提供，PPS也是根据实施例1中方案委托中山大学化学与工程学院合成，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55 %。当然，在本发明的其他实施例中，对于PPS的制备也会根据需要，对其用料和方法上做出调整，以实现解决本发明的技术问题为准。为此， 本发明的技术方案中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40-60kD之间，优选控制在50-60kD 之间，最优为^KD ；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40-50kD之间， 更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。而PPS纳米颗粒的平均粒径则应控制在60_80nm 之间，表面zeta电位为30-40mV。采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分， 能够使本发明的siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。实施例2、PPS/siRNA复合物的制备及其理化性质的测定1、PPS溶于灭菌去离子水，按照不同的N/P比值，将一定量的siRNA溶液与PPS溶液在去离子水或PBS中轻轻混勻，室温下静置孵育10-15分钟，即得到不同N/P值的PPS/ siRNA复合物。其中，PPS/siRNA N/P比值计算公式
PPS (Mg) X45% siRNA (μ )2、粒径和电位的测定按Ν/Ρ比值5，10，15,20形成PPS/siRNA复合物，各复合物所含siRNA量设定为 10 μ g，用去离子水稀释至500 μ 1，用kta-Plus粒度分析仪测定复合物的粒径和电位。每个样本测定5次，所得数值表示为均数士标准差。测定结果表明，PPS的平均粒径是67. 3 士 2. Onm，表面zeta电位为34. 38 士 1. 66mV。 当其与siRNA复合形成PPS/siRNA复合物后，粒径和电位随N/P比值的增加而变化，详见表 1。N/P = 5和10时，复合物粒径分别为98. 5 士 2. 2nm和93. 8 士0. 6nm，随着N/P比值增加粒径缩小，当N/P = 20时复合物粒径为88. 4士 2. 6nm。此外，复合物的zeta电位随着N/P 比值增加而增大，N/P = 5和10时，zeta电位分别为4. 18士0. 18mV和15. 10士0. 64mV，而 N/P = 20 时，zeta 电位增加至 18. 22士 1. 20mV。
表1不同N/P比值下PPS/siRNA复合物的粒径和电位
权利要求
1.一种SiRNA输送载体，其中，所述输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的siRNA输送载体，其中，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的siRNA输送载体，其中，所述超顺磁性氧化铁纳米粒子的分子量控制在40-60kD之间，聚乙二醇-聚乙烯亚胺的分子量控制在40-60kD之间。
4.根据权利要求1所述的siRNA输送载体，其中，所述纳米颗粒的平均粒径为 60-80nm，表面 zeta 电位为 30_40mV。
5.一种真核细胞转染液，其中，所述转染液包括siRNA和如权利要求1-4中任意一项所述的siRNA输送载体，所述siRNA被吸附于siRNA输送载体形成复合物。
6.根据权利要求1所述的真核细胞转染液，其中，所述复合物的N/P比值控制在5-20 之间。
7.一种向细胞输送siRNA的方法，其中，包括将siRNA与如权利要求1_4中任意一项所述的siRNA输送载体制备成复合物，而后根据复合物粒径、表面电位、siRNA复合能力、 细胞毒性和转染率确定合适的N/P比值，再用具有合适的N/P比值的复合物向细胞中转染 SiRNA0
8.根据权利要求4所述的向细胞输送siRNA的方法，其中，siRNA为si⑶44v6，所述 siCD44v6具有如下序列sense strand 5' -GAACAGUG⑶UUGGCAACA dTdT-3‘ <SEQ ID NO. 1>，antisense strand 3' -dTdT CUU⑶CACCAAACC⑶UGU-5‘ <SEQ ID NO. 2>，所述输送载体与si⑶44v6形成复合物，将复合物的N/P比值控制在5-15之间，向胃癌细胞转染siCD44v6。
9.如权利要求1-4中任意一项所述的siRNA输送载体在制备癌症基因治疗药物中的应用。
10.如权利要求5或6中所述的真核细胞转染液在在制备癌症基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种siRNA输送载体，所述输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。另外，本发明还公开了一种真核细胞转染液，包含由siRNA和所述siRNA输送载体组成的复合物。本发明的siRNA输送载体具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102329810SQ201110240290
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者陈茵婷, 黄开红 申请人:陈茵婷, 黄开红