专利名称：亚甲蓝光化学灭活hcv病原体效果的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒灭活检测方法，尤其涉及一种PCR技术检测评价亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果的方法。
背景技术：
输血是临床上治疗和抢救病人常用的医疗措施。近年来，随着医疗技术的不断进步，血液及血液制品的安全性越来越受到人们的重视。输血安全不仅是输血医学和临床治疗学追求的期望目标，也是采供血机构和医疗机构乃至社会各界共同关注的热点和极端敏感的永恒课题。目前，已知有多种病毒可经血液传播，如HIV1/2、HTLVI/II、肝炎病毒HBV和HCV、 HDV和HEV、HAV、非甲 戊肝炎病毒(HGV、TTV、SENV)、CMV和EBV、小病毒B19和新克雅氏病毒等等，都有可能引起输血后病毒性传染病，其中尤其以脂质包膜病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病毒(HIV)危害最大。目前认为提高血液安全性的措施主要是(I)合理的选择献血员、(2)严格的病毒筛选、(3)有效的病毒灭活技术。尽管目前血液检查水平在不断的提高，但是由于检查“窗口期”的存在、以及病毒变异导致免疫反应性的改变、免疫静默感染、新型病毒和亚型变异株的出现等仍使输血时刻存在着风险。采用有效的血液病毒灭活技术是保证输血安全的重要措施之一，也是从根本上解决输血传播病毒风险的有效方法，多年来国外传统病毒灭活方法为巴斯德液体湿热灭活法、有机溶剂/洗涤剂法、干热法、膜过滤法、低PH值孵放法等等，巴斯德液体湿热灭活法主要用于人血白蛋白制品，有机溶剂/洗涤剂法可用于混合血浆，干热法用于冻干制品，膜过滤法只有滤膜孔径比病毒有效直径更小时才能有效去除病毒，而且不能单独使用。上述方法处理难度大、费用高，不能广泛应用于临床用单袋血浆(如100 ml,200 ml)的病毒灭活。由于目前全国各地血站供临床使用的血浆均为单人份血浆，其可能内含的脂质包膜病毒，对人体健康有潜在危害，为了克服此危害，必须对脂质包膜病毒灭活，大量实验数据证明，用亚甲兰光化学处理血浆可完全灭活血浆内所含的VSV和Sindbis病毒(这两种病毒是国内外公认的血液制品病毒灭活有效性的指示病毒，其中VSV是HIV的模型病毒，Sindbis是HCV的模型病毒，均为RNA脂质包膜病毒)。光化学法主要是依靠光敏剂在光照下产生的单线态氧或自由基氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒，各种光敏剂的作用特点不尽相同，如补骨脂内酯衍生物主要产生自由基(一类机制)，酞菁类光敏剂主要产生单线态氧(二类机制)，而酚噻嗪类光敏剂可能同时涉及两类机制，例如单线态氧和光敏剂介导的自由基可能都参与了亚甲兰(MB)光化学处理对病毒的灭活。亚甲蓝(Methylene Blue Photochemistry, MB)光化学灭活血衆病毒是一种最安全、有效的适合于临床用单袋血浆病毒灭活的方法，被认为是非常有发展前景的临床应用单人份血浆病毒灭活方法，早在1966年Pohl和Mohl发表了使用亚甲蓝和光照灭活病毒血浆的临床经验，自1993年起已在德国、瑞士等多个欧洲国家红十字会输血中心使用，并收到良好的临床效果，2001年亚甲蓝灭活病毒方法在上海血液中心研制成功之后，国内大部分血液中心和中心血站已开展此项目。由于病毒灭活技术受到多种因素的影响，因此建立有效的病毒灭活验证方法、直接而客观的评价病毒灭活的有效性是病毒灭活工作的重要组成部分，也是确保灭活效果达到预期要求、保障血液和血液制品安全性的关键环节。目前多采用体外培养的细胞病变法或动物模型法来判断病毒灭活效果，体外培养方法对实验条件有着严格的要求，对细胞培养、病毒保存有着严格规范，操作繁琐、实验周期长，不利于在基层单位开展，并且因其基于在体外观察病毒靶细胞病变的原理而难以评价其靶细胞无法在体外培养的病毒(如肝炎病毒)的灭活效果；虽然动物模型方法从生物整体水平评价病毒感染性方面具有优势，但是价格昂贵、实验周期长，只适用于研究开发阶段实验，而且对多数人类致病病毒缺乏敏感的模型动物较少，不适合在常规工作中开展，因此建立更简便易行、更经济、更有效的评价指标已成为病毒灭活工作急需解决的问题。核酸检测技术是以检测样本内病毒核酸的有无或含量多少进行病原学诊断的一 种方法，是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断检测技术，灵敏度高、特异性强，能够采用定量检测的方法进行质量监控，具有准确性高、检测成本低、耗时少的优点，已被用作病毒感染的常规诊断方法，其中PCR检测是众多核酸检测技术中的经典方法，因其简便快速的特点，很容易被基层检验单位及血站所接受。在病毒灭活有效性评价工作中，病毒灭活质控品的建立是至关重要的。
发明内容
本发明提供了一种检测评价亚甲蓝光化学法灭活HCV病原体效果的方法，以HCV病毒样颗粒为质控品，利用PCR技术，检测亚甲蓝光化学灭活处理效果，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。本发明亚甲蓝光化学法灭活HCV病原体效果的检测方法，步骤如下
步骤1，RNA包膜技术构建的含HCV病毒RNA的HCV病毒样颗粒(或称为HCV假病毒颗粒)作为质控品，所述HCV病毒样颗粒由含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白、包膜蛋白的基因编码序列、部分调节元件序列以及HCV病毒RNA 5’非编码序列的重组载体原核表达而成；步骤2，将所述HCV病毒样颗粒浓度稀释，与HCV血浆同时进行亚甲蓝光化学处理，并平行检测其核酸变化；
步骤3，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。其中，所述核酸变化检测方法为荧光定量PCR检测。其中，所述浓度稀释为HCV病毒样颗粒用代血浆稀释100倍。其中，所述代血浆为羟乙基淀粉注射液。本发明将PCR检测技术应用于血液和血液制品病毒灭活有效性的检测中，操作简单，准确度好，实验周期短，更为经济有效，可用于亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果质量的检测评价。由于常规采供血工作对环境有严格要求，质控品材料必须保证对操作人员和受血者物感染性，对人体不致病，因此，本发明以假病毒颗粒为质控品，可避免质控品对人的感染。
图I为HCV病毒核酸量经亚甲蓝光化学处理前后的结果；
图2为亚甲蓝光化学处理前后病毒核酸的扩增抑制率；
图3为HCV病毒样颗粒以及HCV血浆核酸下降量线性关系；
图4为HCV病毒样颗粒重组表达质粒的结构。
具体实施例方式本发明提供了一种亚甲蓝光化学法HCV病毒灭活效果的检测方法，以利用包膜RNA技术构建的假病毒颗粒为质控品，在相同条件下对血液和质控品进行亚甲蓝光化学灭活，PCR检测灭活前后质控品病毒核酸量的变化，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。HCV病毒样颗粒重组表达质粒的结构如图4所示。下面通过具体实施例对本发明检测方法进行进一步详细描述和介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。I.包膜RNA表达质粒的构建
设计引物扩增PMS27质粒(购于BCCM)中MS2 I. 7kb目的片段(82 1742片段)，从BamHI和，Hind III位点插入pET28a质粒，构建到pET28_MS2P重组质粒。具体操作方法可参照本发明领域现有技术进行，优选地，所设计引物如下
CGGGATCCGGCTATCGCTGTAGGTAGCC ；
GCAAGCTTU TGGGTGA TCCTCA TCA rAATGGCCGGCGTCTATTAGTAG ；
其中，GGATCC 为 BamH I 位点，AAGCTT 为 Hind III 位点。本发明设计的上述引物中，引入了定点突变pac位点(斜体部分) ACATGGGTGATCCTCATCAT,能够提高包膜RNA的包装效率。2.含HCV病毒RNA片段的包膜RNA表达质粒的构建
提取HCV病毒基因组RNA，使用引物逆转录PCR扩增SV病毒，然后从Hind III位点克隆入pET28-MS2P重组质粒，构建得到pET28-MS2P-H重组质粒。3. HCV病毒样颗粒的表达与纯化
将pET28-MS2P和pET28-MS2P-H重组质粒分别转化如BL21原核表达体系，IPTG诱导表达18h，收集表达后的细胞。使用超声破菌仪(Sonics vcl30)再冰浴中破碎细胞后进行离心分离，去上清进行DNase I (购自Fermentas)和TNase A (购自Fermentas)消化，消化产物加入CsCl (购自上海生工)至浓度为O. 6g/ml,4°C>45000rpm/min离心分离20h进行纯化，合并离心后含有假病毒颗粒的部分，使用超滤管(Millipore)离心富集，待用。将破菌后的产物分别进行DNase I.TNase A消化以及DNase I和TNase A双酶消化，消化后的产物直接进行琼脂糖凝胶电泳进行稳定性鉴定。取消化后的产物使用Trizol法抽提RNA之后，进行RT-PCR和PCR反应进行特异性鉴定，所述稳定性鉴定方法如下含质粒pET28-MS2P和质粒pET28-MS2P-H的BL21表达菌经过IPTG诱导表达后，超声破菌取上清，分别取200 μ L进行DNase I和TNase A双酶消化，与未消化产物一同进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，经过双酶消化后只有一条稳定条带，而未经消化的则含有其他条带。所述特异性鉴定方法如下消化后的假病毒颗粒进行RNA抽提，抽提产物分为两管，一管进行RT-PCR检测，另一管直接进行PCR反应，将两管RCR产物电泳可见，只有HCV假病毒颗粒的RT-PCR结果有条带。4.亚甲蓝光化学灭活
HCV病毒样颗粒灭活样品的制备将病毒样颗粒储存液用代血浆(羟乙基淀粉注射液)稀释100倍后混合均匀。HCV血浆样品的准备将保存于-80°C的HCV血浆于37°C融化后混匀。将上述各灭活样品于避光条件下加入亚甲蓝，使其终浓度为I μ mol/L。将样品液以每袋5mL分装于PVC小袋，置于病毒灭活照射箱中进行光照处理，光照强度为350001UX，分别在照射不同时间点取样检测，设定不加亚甲蓝且不光照的为空白对照组。每组实验重复3次。 5. PCR检测评价病原体灭活效果 HCV病毒RNA的核酸检测
应用丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测试剂盒检测(购自匹基生物)。I)将所有提取试剂平衡至室温，按说明书于每次使用前新鲜配制裂解液工作液。2)抽提病毒RNA :向离心管中加入25 μ L蛋白酶溶液，分别加入待测样本、HCV阴性对照品、HCV临界阳性对照品以及HCV强阳性对照品各200 μ L0加入200 μ L裂解液工作液，振荡混匀15s ;于56°C水浴15min，瞬时离心。加入250 μ L无水乙醇,振荡混勻15s,室温静置5min,瞬时离心。将上步的液体移入纯化柱中，6000g离心lmin，倒掉收集管内液体。向柱内加入50(^1^洗液1，600(^离心lmin，倒掉收集管内液体。向柱内加入500 μ L洗液2，6000g离心lmin，倒掉收集管内液体。向柱内加入500μ L无水乙醇，6000g离心lmin，将柱置于新收集管内。20000g离心3min，丢弃收集管，将纯化柱放入干净的I. 5mL离心管中，开盖于56°C温浴3min。将纯化柱置于另一干净的I. 5mL离心管中，加入60 μ L洗脱液,室温静置5min,20000g离心lmin收集滤出液。荧光定量PCR检测
将逆转录及扩增所需试剂融化后，2000g离心5s，按照如下体系配制反应液每个体系为28 μ L HCV RT-PCR反应液+2 μ L Enzyme Mix ;混匀后，向各反应管中分装30 μ L。向反应管中加入20 μ L样本RNA,混匀后于突光定量PCR仪内检测，反应条件为500C 30min,95°C 15
min ；95°C 15s,50°C 45s, 72°C 15s，荧光信号收集设在50°C，共45个循环。仪器检测通道选择Fam检测通道。6.结果
HCV病毒样颗粒及HCV血浆的亚甲蓝光化学灭活效果见图广2。HCV病毒样颗粒以及HCV血浆的核酸下降量及其线性关系见图3和表I。线性回归方差分析见表2。结果显示，HCV病毒样颗粒与HCV血浆具有详细的核酸动力学曲线以及扩增抑制率曲线，且其线性相关性分析显示两者间呈现极显著的线性相关性，R2X). 99。这说明HCV病毒样颗粒的核酸扩增抑制能够反映HCV血浆的核酸扩增抑制，进而具有作为HCV亚甲蓝光化学灭活评价质控品的可行性。表1，HCV病毒样颗粒以及HCV血浆的核酸下降量
权利要求
1.一种亚甲蓝光化学灭活HCV病原体效果的检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下 步骤1，RNA包膜技术构建的含HCV病毒RNA的HCV病毒样颗粒作为质控品，所述HCV病毒样颗粒由含有MS2噬菌体的成熟酶蛋白、包膜蛋白的基因编码序列、部分调节元件序列以及HCV病毒RNA 5’非编码序列的重组载体原核表达而成； 步骤2，将所述HCV病毒样颗粒浓度稀释，与HCV血浆同时进行亚甲蓝光化学处理，并平行检测其核酸变化； 步骤3，判病毒灭活效果，质控品灭活效果即为HCV病毒灭活效果。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述核酸变化检测方法为荧光定量PCR检测。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述浓度稀释为HCV病毒样颗粒用代血浆稀释100倍。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述代血浆为羟乙基淀粉注射液。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测评价亚甲蓝光化学法病毒灭活效果的方法，以包膜RNA技术构建的HCV假病毒颗粒为质控品，在相同条件下对质控品和需要进行病毒灭活的血液或血液制品在相同条件下进行亚甲蓝光化学病毒灭活。该方法对人体没有病毒感染风险，可通过假病毒颗粒核酸的损伤程度反映HCV感染性的消失情况。
文档编号C12Q1/70GK102965450SQ201110256249
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者张博, 郑岚, 王迅, 黄宇闻, 莫琴, 钱开诚 申请人:上海市血液中心