专利名称：防治黄瓜白粉病和霜霉病的菌株chs55的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治温室大棚黄瓜白粉病和霜霉病的生防菌株CHS55，属于植物保护技术领域，专用于黄瓜叶部的霜霉病和白粉病无公害防治。
背景技术：
黄瓜霜霉病和白粉病是温室大棚黄瓜叶部最常发生的两种真菌病害它们的病原菌都为专性寄生菌，且对寄主植物的专化选择性很强，其孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农器具等进行传播，都是一种主要的气传病害。随着我国温室大棚面积急剧增加，反季节黄瓜大棚栽培种植大批量出现，使得其病菌一年四季可以侵染黄瓜；发病严重时，全叶呈黄褐色干枯，最后导致植株干枯早死，缩短收瓜期，严重影响黄瓜产量，损失可达20%到60%，此病害是温室大棚影响黄瓜产量的主要制约因素之一。此病害农民主要是依照经验来喷施化学药剂，一周喷施一次化学药剂，但抗性产生的速度非常快，目前不少商家把目光转移到绿色、生态产品生物农药上，但大多处于实验室研究开发阶段，登记注册的微乎其微。且因两种病原菌是活体寄生菌，大多完成简单的室内测定试验，在我国主要黄瓜栽培区进行日光温室或者露天试验药效广谱性测试的生防研究微乎其微。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉和白粉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全可持续发展的需要，符号社会发展需求。
发明内容
1技术问题针对现有技术中没有对黄瓜霜霉病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治黄瓜霜霉病的单一生防菌菌株及其菌剂，该菌剂对其防效可达到60%以上。2技术方案防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CHS55，为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，于2011年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 4738，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。生防菌株CHS55用于制备生防菌剂的方法为所述生防菌株CHS55接种到LB培养液中32°C培养250rpm振荡培养，12 16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.5 0.8之间时，将种子菌液以1 500体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，32°C 250rpm振荡培养20 M小时，发酵液pH值维持在7. 0，溶氧量20%，通气量5-7m7小时，罐压0. 05-0. IKPa,然后6000rpm离心lOmin，每1000ml培养液获得13 16g湿菌，每克湿菌含4X101(I IO15个菌体，取湿菌与菌体保藏液按Ig 40ml
3配成菌剂，成品中活菌总浓度为IXio9 lX1012CFU/ml。其中1)种子培养液LB配方氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为 7.2 ；2)发酵培养液配方麦芽糖1. 2g/L，玉米粉3. 2g/L，黄豆粉3. 2g/L，胰蛋白胨 2. Og/L，二水氯化钙0. 5g/L，一水硫酸锰0. 5g/L，磷酸氢二钾1. Og/L,调节pH值为7. 0 ；3)菌体保藏液为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的TweeMO 非离子型表面活性剂。菌剂稀释100-1000倍后在黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷灌处理，在天气因子适合黄瓜霜霉病流行前期，10d/7d 一个间隔周期使用一次，对黄瓜霜霉病的防效可分别达到为62. 31%和65. 79%。在温室试验中后期发现，其对白粉病控制有较强的作用，防效可达到70%以上，且其粗蛋白提取液对黄瓜霜霉病防效可达到70. 33%。3有益效果本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对黄瓜叶部两种病害霜霉病和白粉病病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于温室大棚蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量， 这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。温室实验表明该菌制剂能显著降低黄瓜霜霉病的发生。该菌剂可以稀释100倍后在黄瓜种子出苗后喷雾，或者在移栽时灌根/喷雾处理。在温室条件下对于黄瓜霜霉病可以达60%，且其粗蛋白提取液对黄瓜霜霉病防效可达到70. 33% ；在温室试验中后期发现，其对白粉病控制有较强的作用，防效可达到70%以上。
四
具体实施例方式实施例1CHS55生防菌剂的制备本发明涉及一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CHS55，该菌株为2009年在扬州某黄瓜大棚的黄瓜健康土壤分离得到。1)将所述生防菌株CHS55接种到LB培养液中32°C培养250rpm振荡培养，12 16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.5 0.8之间时，将种子菌液以1 500体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，32°C 250rpm振荡培养20 M小时，发酵液pH值维持在7. 0，溶氧量20%，通气量5-7m7小时，罐压0. 05-0. IKPa,然后6000rpm离心lOmin，每1000ml培养液获得13 16g湿菌，每克湿菌含4X101(I IO15个菌体，取湿菌与菌体保藏液按Ig 40ml 配成菌剂，成品中活菌总浓度为IXlO9 lX1012CFU/ml。其中1)种子培养液LB配方氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为 7.2 ；2)发酵培养液配方麦芽糖1. 2g/L，玉米粉3. 2g/L，黄豆粉3. 2g/L，胰蛋白胨 2. 0g/L, 二水氯化钙0. 5g/L，一水硫酸锰0. 5g/L，磷酸氢二钾1. 0g/L,调节pH值为7. 0 ；
3)菌体保藏液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的TweeMO 非离子型表面活性剂。实施例2黄瓜霜霉病温室防效试验黄瓜移栽后四叶期，用生防菌CHS55 (107CFU/mL)喷雾处理黄瓜叶片，5d后接种黄瓜霜霉病菌(Psedoperonspora cubensis)孢子囊悬浮液，接种浓度为IO5个孢子囊/ml，对照处理组为清水对照。每个处理组M株黄瓜苗，四次重复。第IOd对照组发病，调查病级数，计算病害严重度和防效。(参考文献NY/T 1156. 7-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第7部分防治黄瓜霜霉病试验盆栽法)霜霉病病原菌 Pseudoperonospora cubensis (Berkely et Curtis) Rosto wzew, 公知公用，见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报，1994， (06).，，。病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008)傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药)，用冰壶带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的抱子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18°C培养箱中黑暗保湿培养，24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000rpm 15min离心，弃去上清液，用灭菌水稀释至IO5个孢子囊/ ml，在18°C培养箱中黑暗培养2-3h，待有大量游动孢子囊出现时使用。数据显示，CHS55对黄瓜霜霉病防效为57. 27%。表1 温室中生防菌剂CHS55对黄瓜霜霉病生防效果(喷雾处理IOd)
处理病害严重度％生防效果％CHS558.61±2.30b57.27Control20.15±4.24a实施例3对黄瓜白粉病的温室试验防效黄瓜移栽后四叶期，用生防菌CHS55 (107CFU/mL)喷雾处理黄瓜叶片，控制室温和室内相对湿度85%，IOd后可见白粉病发生，对照处理组为清水对照。每个处理组M
株黄瓜苗，四次重复。第IOd对照组发病，调查病级数，计算病害严重度和防效。(参考文献NY/T 1156. 4-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第4部分防治小麦白粉病试验盆栽法)黄瓜白粉病病原菌为子囊菌亚门的单丝壳白粉菌属 [Sphaerothecafuliginea (Schl.) Poll = S. cucurbitae (Jacz.) Zhao]，其无性阶段归半知菌亚门的粉孢属[Oidium sp.]，见参照文献“张雪辉.室内黄瓜白粉病防治方法研究[J]. 河北师范大学学报，2005，(02). ”。分生孢子悬浮液的制备(杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008))采集黄瓜植株叶片上新鲜的分生孢子.用无菌水冲洗，制成分生孢子悬浮液(8*104个/mL)。从分生孢子悬浮液制备至完成接种应限定在池内。分级标准参考中华人民共和国国家标准(农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治黄瓜自粉病，GBFF17980. 30-2000)
5
0级无病斑；1级病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级病斑面积占整片叶面积的6% -10% ；5级病斑面积占整片叶面积的11^-20% 7级病面积占整片叶面积的 21% 40% :9级病斑面秋占整片叶面积的40%以上表2 温室中生防菌剂CHS55对黄瓜白粉病生防效果(喷雾处理IOd)
权利要求
1.一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CHS55，为地衣芽孢杆菌iMcillus licheniformis),予2价Y年 只1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 4738，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
2.用权利要求1所述防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CHS55制备的生防菌剂。
3.权利要求1所述生防菌株CHS55用于制备生防菌剂的方法1)将权利要求1所述生防菌株CHS55接种到LB培养液中32°C培养250rpm振荡培养，12 16小时后在超净工作台中分别取样测600 nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.5 0. 8之间时，将种子菌液以1 :500体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，32°C 250 rpm振荡培养20 M小时，发酵液pH值维持在7. 0，溶氧量 20%，通气量 5-7 m3/小时，罐压 0.05-0.1 KPa，然后 6000 rpm 离心 10 min，每 1000 ml 培养液获得13 16 g湿菌，每克湿菌含4 X 101° IO15个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为IXlO9 IXlO12 CFU/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其中1)种子培养液LB配方氯化钠10g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L，调节pH 值为7. 2 ；2)发酵培养液配方麦芽糖1.2g/L,玉米粉3. 2 g/L,黄豆粉3. 2 g/L,胰蛋白胨 2.0 g/L, 二水氯化钙0.5 g/L，一水硫酸锰0.5 g/L,磷酸氢二钾1. 0 g/L，调节pH值为 7. 0 ；3)菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001 mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。
全文摘要
本发明涉及一种防治温室大棚黄瓜白粉病和霜霉病的菌株CHS55，属于植物保护技术领域。CHS55菌株在LB培养液32℃250rpm振荡培养18-20h，然后4000rpm离心15min，取湿菌与本实验室的菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1012CFU/mL。稀释100-1000倍后在黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷灌处理，在天气因子适合黄瓜霜霉病流行前期，10d/7d一个间隔周期使用一次，对黄瓜霜霉病的防效可分别达到为62.31%和65.79%。在温室试验中后期发现，其对白粉病控制有较强的作用，防效可达到70%以上，且其粗蛋白提取液对黄瓜霜霉病防效可达到70.33%。
文档编号C12N1/20GK102399712SQ20111026213
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者王勇明, 许泉, 郑丽, 郭坚华 申请人:南京农大生物源农药创制有限公司