恶性疟原虫pfs25蛋白突变体及其酵母表达方法

专利名称：恶性疟原虫pfs25蛋白突变体及其酵母表达方法
技术领域：
本发明属于传染病防治领域，具体涉及疟疾的防治，尤其涉及用于传播阻断型恶性疟疾疫苗的候选靶抗原。
背景技术：
疟疾是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上有20亿人口生活在疫区。每年全球大约有3亿人口患病，其中50 %是由恶性疟疾原虫引起的，5岁以下儿童患病人数约为250万，每年死于疟疾的人口约100万-300万。我国疟疾每年患病人数为10 万左右。近年来，随着抗药疟原虫(疟疾病原体)和抗药按蚊(传播媒介)的出现，疟疾的防治面临更大的挑战。疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期，即在有性阶段的配子期和无性阶段的细胞前期及红细胞内期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清晰，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。对疟原虫抗原的研究，人们发现某些特异性抗原，有望成为疟疾疫苗的侯选物。其中一些重要抗原，如在子孢子表面表达的环子孢子蛋白(CSP)、在肝和血两个时期表达的裂殖子表面蛋白(MSP)、在有性阶段表达的合子表面或动合子表面抗原(Pfs^)等，已经作为疟疾候选疫苗的保护性抗原，并取得了初步的成果。1988年Kaslow DC等首次报道了位于合子或动合子表面膜蛋白的Pfs25蛋白质，结果表明该蛋白质由217个氨基酸组成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四个“EGF 样的结构域” (Nature. 1988May 5 ；333 (6168) :74-6.)。1991 年 BarrPJ 等报道了重组 Pfs25蛋白作为传播阻断型疫苗在试验动物上的效果(The Journal of experimental medicine. 1991Nov 1 ； 174(5) :1203-8. )。KaslowDC 等在美国专利 US5217898 公开了酵母表达Pfs25突变体的方法，该突变体称为Pfs25B，由相当于Pfs25天然序列22-188位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成丙氨酸。2003 年hu L等报道在毕赤酵母中表达pfs25蛋白质突变体，该突变体相当于Pfs25天然序列 23-193位的氨基酸组成，其中相当于天然序列112、165、187位的天冬酰胺被替换成谷氨酰胺(Vaccine. 2003Apr2 ；21 (15) :1650-7.)。尽管上述两种突变体在动物体内表现出传播阻断作用，并进行了 I期临床安全性研究，但在进一步开发中都存在问题。因此本领域迫切需要研制有效的药物或疫苗来防治这种疾病。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，作为传播阻断疫苗的候选抗原。本发明要解决的另一问题是提供一种高效、经济的酵母表达Pfs25 蛋白突变体的方法。本发明的第一方面，提供了一种恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，该突变体相当于Pf s25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺突变为谷氨酸，具体见SEQl。本发明的第二方面，提供了一种采用酵母偏爱密码子的编码Pfs25蛋白突变体的核苷酸序列，具体见SEQ2。本发明的第三方面，提供了一种在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白突变体的方法，包括如下步骤(1)将Pfs25蛋白突变体编码基因置于三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的下游， 构建重组酵母菌；(2)以YPD培养基培养重组酵母菌；(3)补加葡萄糖维持发酵液中的葡萄糖终浓度在0. 5 lg/L范围；(4)培养M 72小时，收获培养上清，提取目的蛋白。其中所述的Pfs25蛋白突变体是指相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸替换。更优选的，相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187 的天冬酰胺被谷氨酸替换。最优选的，Pfs25蛋白突变体是SEQl定义的突变体。在一个优选的方案中，Pfs25重组酵母菌在29. 0°C、pH6. 0 4. 0、溶氧> 20%、条件下发酵培养。在更优选的方案中，发酵过程中发酵过程中转速约350rpm，保持通气速度200L/ h (压缩气体)。在更优选的方案中，发酵液中加入Antifoam 204作为消泡剂。本发明的恶性疟原虫Pf s25蛋白突变体(简称Pfs25_3E)，能够与针对Pfs25标准蛋白的单克隆抗体4B7特异性反应，用于小鼠免疫，能够诱导产生高滴度的抗Pfs25抗体， 是一种可用于阻断传播疫苗研制的良好的候选抗原。与现有技术报道的Pfs25蛋白突变体(简称Pfs25_3Q)相比，本发明的突变体在毕赤酵母宿主中的表达量高。在本发明一个实施方案中，两种突变体重组菌在相同条件下， Pfs25-3E表达量占上清中分泌蛋白的70%，Pfs25-3Q仅为16%。由于本发明的突变体在酵母中高表达的特性，在利用发酵罐培养过程中，发酵体系只需补加葡萄糖即可，而且24h后就可以获得表达产物，本发明的突变体大大简化了发酵培养工艺，缩短了培养周期。另一方面，由于本发明的突变体表达量占上清中分泌蛋白的 70%，仅用一步离子交换层析(1. OM NaCl洗脱)即可从表达上清中分离出目标蛋白峰，得到纯度达95%以上的目标蛋白。如果采用离子交换层析(0.3M NaCl洗脱)、凝胶过滤层析两步纯化，即可得到纯度达95%以上的目标蛋白，较一步法实现更高的收率。因此，本发明的突变体的高表达特性大大简化了纯化工艺。总体而言，本发明的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，与Pfs25标准蛋白具有相同的免疫原性，能够在毕赤酵母中高表达，有望成为优异的疟疾传播阻断疫苗的候选抗原。


图1 重组表达质粒pfs25_3E/pGAPZ α A酶切鉴定泳道1 :DL2000DNA marker, 2000，1000，750，500，250，100泳道2 =XhoI 和 XbaI 双切 pfs25_3E/pGAPZ α A 重组质粒
图2 从重组酵母菌pfs25_3E/pGAPZ α A/G中PCR鉴定pfs25基因泳道1 :pGAPZ α A/G酵母菌(阴性对照)泳道2 :DL2000DNA marker泳道3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组酵母菌图 3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 72 小时表达上清 SDS-PAGE 分析泳道 1 :protein marker (kd) :96，67，43，31，21，14
泳道2 :pfs25标准蛋白泳道3-8 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G阳性克隆表达产物泳道9 :pGAPZ α A/G酵母菌(阴性对照)图 4 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌表达产物 Western-blot 鉴定泳道1 :pGAPZ α A/G (阴性对照)泳道2 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌M小时表达泳道3 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌 48 小时表达泳道4 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌 72 小时表达泳道5 :pfs25标准蛋白图5 :pfs25-3Q/pGAPZ α A/G 重组菌表达分析泳道1 :pfs25标准品；泳道2-10 :Q2-Q 10克隆重组菌表达产物图 6 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G 重组菌表达分析泳道1 :pfs25标准品；泳道2-9 :E2-E 9克隆重组菌表达产物图7 不同代次pfs25_3E/pGAPZ α A/G重组菌表达上清的SDS-PAGE分析泳道1 :pfs25标准蛋白泳道2-9 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌传代1-8代72小时表达产物图8 不同代次pfs25_3E/pGAPZ α A/G重组菌PCR鉴定泳道1 :pGAPZ α A/G (阴性对照)泳道 2 第 1 代 pfs25_3E/pGAPZ α A/G 重组菌泳道3 第 3 代 pfs25_3E/pGAPZ α A/G 重组菌泳道 4 :DL2000DNA marker泳道5-8 第 5-8 代 pfs25_3E/pGAPZ α A/G 重组菌图9 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌表达上清离子交换层析泳道1 :1. OMNaCl洗脱峰；泳道2 :0. 3MNaCl洗脱峰泳道3 流穿峰；泳道4 柱前样图10 :pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌表达上清凝胶过滤层析泳道1-6 分部收集的第1至6管管样品
具体实施例方式传播阻断疫苗针对疟原虫有性阶段的配子期和无性阶段的细胞前期及红细胞内期的不同抗原，疟疾疫苗分3大类肝内期疫苗、红内期疫苗以及传播阻断疫苗(transmission-blocking vaccines,TBVs)。传播阻断疫苗是以蚊阶段疟原虫特异表达的虫体表面蛋白作为抗原免疫人体，使之产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。蚊吸入被免疫的人血后，蚊中肠内发育的疟原虫与人的抗体产生抗原抗体反应，从而导致蚊体内疟原虫有性生殖及孢子增殖受到阻断。目前研究较多的传播阻断疫苗候选抗原有恶性疟原虫相关蛋白Pfs25、Pfs28、 Pfs48/45 和 Pfs230,间日疟相关蛋白 Pvs25、Pvs28、Pvs48 等。虽然传播阻断疫苗不能预防免疫个体感染疟疾，亦不能减轻疟疾症状，但能阻断按蚊将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主。当这种疫苗与疟疾保护性疫苗或抗疟药联合应用时，TBVs可阻断那些对药物产生抗性而幸存下来的疟原虫的传播。TBVs的另一个用途是对旅游者进行免疫，以防止他们将疟原虫带入非流行区，造成流行。由于肝内期疫苗、红内期疫苗候选抗原分子暴露于人体免疫系统，受到人体免疫压力等因素的影响，候选抗原存在广泛的基因多态性。TBVs候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面，此类抗原并不在脊椎动物免疫系统选择压力之下，所以这些蛋白显示出非常低的多态水平，不会出现抗原变异，有利于疫苗免疫效果，被认为可以有效地阻断疟疾从蚊媒向人的传播，是当前疟疾疫苗研究的热点之一。天然Pf s25抗原Pfs25 (Plasmodium falciparum surface protein 25)
子主要表面蛋白，是介导动合子穿越围食膜和对蚊中肠壁基底膜侵入的关键性蛋白。天然的pfs25蛋白质，存在于恶性疟原虫子孢子囊膜表面，由217个氨基酸组成，分子量25Kd，富含半胱氨酸。在结构上，Pfs25天然蛋白的N端22个氨基酸是信号肽序列，C端的M个氨基酸是膜结合区域，该蛋白存在四个“EGF样的结构域”，23个半胱氨酸形成了九个二硫键。 Pf s25是糖蛋白，一共有四个糖基化位点，其中，112、165、187和202位的天冬酰胺(Asn， N)上形成了 N型糖链，196位的丝氨酸(kr，S)上形成了糖基化磷脂酰肌醇锚定的糖链 (GPI-anchor)。参见 Kaslow DC 等在 Nature. 1988May 5 ；333 (6168) :74-6.的公开。用于酵母表达的启动子毕赤酵母经过近二十来年的发展，已成为外源蛋白的优秀表达系统之一，因其具备操作简单、表达量高、成本低的优点，以及酵母菌可以实现蛋白质的翻译后修饰特点，使其得到了广泛的应用。常用的适于酵母表达的启动子包括(1)醇氧化酶(AOX)启动子。该启动子属于诱导表达型启动子，当在培养基中添加甲醇时，可诱导PAOXl下游的外源基因表达。( 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子。该启动子属于组成型表达启动子。本发明分别构建了 pfs25/pGAPz α A、pfs25/pPICz α A两种重组体，转化毕赤酵母 GSl 15菌株得到两种表达pfs25的酵母重组pfs25/GAP/G和pfs25/pPICz α A/G。用于酵母表达的培养基用于酵母培养及表达外源基因的培养基有多种，本发明所用的培养基有(I)YPD 培养基基础配方1% Yeast Extract (酵母膏)、2 % Peptone (蛋白胨)、2 % Dextrose (glucose)(葡萄糖)，通常用于酵母的基础培养或组成型表达。在基础配方内添加2%琼脂成为固体培养基；在基础配方内添加抗生素kocin， 称为YPDZ培养基。
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(2) BMGY/BMMY 培养基BMGY配方为酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6. 0)，1. 34 % YNB，4X10_5生物素，甘油；上述配方中甘油改换成0.5%甲醇，称为BMMY培养基；通常用于酵母系统的诱导型表达。上述培养基及本发明所用的大肠杆菌低盐LB培养基等的配方及配置方法，可参考hvitrogen公司的毕赤酵母表达手册。Pfs25蛋白突变体天然Pfs25是糖蛋白，有四个糖基化位点，具体为112、165、187和202位的天冬酰胺(Asn，N)上形成了 N型糖链。Pfs25蛋白采用酵母表达，常常出现过度的糖基化修饰以及表达产物的不均一的问题。在已有的研究中，Kaslow DC将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为丙氨酸(Ala，Α)后在酵母表达，使其丧失糖基化功能，得到较均一的表达产物，参见 Nature. 1988May5 ;333 (6168) :74-6.以及 US5217898。该 pfs25 蛋白突变体曾进行过 I 期临床研究，用该突变体制备的单抗4B7，目前已经成为pfs25蛋白的标准化单抗供全球研究人员使用，参见 The Journal of experimental medicine. 1991Nov 1 ； 174(5) :1203_8。 2003年，Zou L将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(Gln，Q)，在酿酒酵母和毕赤酵母中成功表达，美国NIH基于该突变体进行了 I期临床研究，结果参见^uL等在 Vaccine. 2003Apr2 ；21 (15) :1650-7.的公开以及 Wu Y 等在 PloS one. 2008 ；3 (7) :e2636. 的公开。本发明将112、165、187三个位点的天冬酰胺突变为谷氨酸(Glu，Ε)，在毕赤酵母中成功表达，得到的Pf s25突变体能够和4B7单抗特异性反应，且在接种小鼠后可以获得良好的免疫应答。酵母表达质粒pPICz α A、pGAPz α A、Zeocin抗生素和菌株GSl 15均购自 hvitrogen公司；限制性内切酶XhoI、XbaI、BstXI和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶购自Roche公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司；PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；标准蛋白质分子量购自GE公司。抗Pfs25单克隆抗体 4B7 禾口 Pfs25 标准蛋白由美国 MR4 (Malaria Research and Reference Reagent Resource Center, NIH)惠赠；HRP标记兔抗鼠IgG以及Antifoam 204消泡剂购自Sigma公司；其他试剂为进口或国产分析纯。实施例1、Pfs25突变体基因的合成和表达载体的构建(1)目的基因及扩增引物的设计与合成根据GenBank中公布的Pfs25基因信息(GenBank locus X07802)，其编码的天然 Pfs25蛋白第23位至第193位氨基酸序列如下KVTVDTVCKRGFLIQMSGHLECKCENDLVLVNEETCEEKVLKCDEKTVNKPCGDFSKCIKIDGNPVSYA CKCNLGYDMVNNVCIPNECK g VTCGNGKCILDTSNPVKTGVCSCNIGKVPNVQDQNKCSKDGETKCSLKCLKE g
ETCKAVDGIICDCKDGFIID g ESSICT其中相当于天然pfs25蛋白第112，165，187位为天冬酰胺(Asn，N)，是pfs25蛋白的糖基化位点。本发明的pfs25蛋白突变体，相当于天然Pfs25蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺突变为谷氨酸，具体见序列表SEQl。按照毕赤酵母喜好密码子设计编码本发明突变体(SEQl)的核苷酸序列，见序列表SEQ2。Zou L 等在 Vaccine. 2003Apr 2 ；21 (15) :1650-7.公开的 Pfs25 蛋白突变体，与本发明突变体的区别是相当于天然Pfs25蛋白112、165、187的天冬酰胺突变为谷氨酰胺。 我们按照毕赤酵母喜好密码子设计编码hu L等报道的突变体的核苷酸序列，见序列表 SEQ3。SEQ2与SEQ3相比，除了对应于Pfs25天然蛋白112，165，187位氨基酸的核苷酸密码子不同，其他部分均相同。本发明还设计了 Pfs25基因特异性PCR引物，用于酵母重组菌PCR鉴定，序列如下上游引物:ggACTC gAg AAA AgA gAg gCT gAA gCT ATg AAA gTA ACAgTCg (下划线为BioI酶切位点)；下游引物TggTCTAgATTA AgT ACA TAT TgA TgA TTC CTC(下划线为 XbaI 酶切位点)O 上述SEQ2目的基因、SEQ3对照基因及PCR引物均委托上海生工生物工程有限公司合成，上海生工生物工程有限公司合成的SEQ2目的基因、SEQ3对照基因分别克隆到pUC57 载体，称为Pfs25-3E/pUC57、Pfs25-3Q/pUC57，测序正确；合成引物以冻干形式提供。(2)表达载体构建包含目的基因的克隆载体Pfs25_3E/pUC57和包含三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的酵母表达载体PGAPZ α A，分别用限制性内切酶B10I和)(baI进行双酶切操作。利用T4DNA连接酶将目的基因亚克隆到pGAPZ α Α,得到重组质粒Pfs25_3E/pGAPz α Α,转化 Ε. coli ToplO', PCR、酶切和测序鉴定阳性克隆。利用BioI和)(bal双酶切鉴定重组表达质粒Pfs25_3E/pGAPZ α Α,电泳图谱可以看到在500bp的位置有目的基因条带，见图1。对重组质粒pfS25-3E/pGAPZaA中目的基因测序，结果正确。采用相同方法，目的基因克隆到包含醇氧化酶(AOX)启动子的酵母表达载体 pPICz α A上，得到重组质粒pfs25-3E/pPICz α Α，酶切、测序鉴定结果正确。采用相同方法，将对照基因Pfs25_3Q(SEQ3)克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶 (GAP)启动子的酵母表达载体pGAPZ α Α,得到重组质粒pfS25_3Q/pGAPZ α Α,酶切、测序鉴定结果正确。实施例2、酵母重组菌的构建及鉴定阳性重组表达质粒Pfs25-3E/pGAPz α A经BstXI酶切线化后，电转染法转化感受态毕赤酵母GS115 ；以空白质粒pGAPz α A转染酵母菌，制备阴性对照菌株。电转条件 1. 5kV,250yF,200Q 0电击结束后，立即加入800 μ 1 IM山梨醇，混勻，30°C放置2小时，取适量转化物涂布于含有100 μ g/ml kocin的YPD固体筛选培养基上，30°C湿盒静置，3-5天后可见单克隆菌落出现。随机挑取若干菌落接种于:3mlYPD培养基中，30°C生长过夜，收集菌体。提取酵母基因组DNA，PCR鉴定，结果如图2。阳性克隆为Pfs25-3E/pGAPzaA/G。采用相同方法制备得到阳性酵母重组菌Pfs25-3E/pPICz a A/G。采用相同方法制备得到阳性酵母重组菌pfs25-3Q/pGAPZ a A/G。实施例3、目的基因的表达及表达产物的鉴定
Pfs25-3E/pPICz α A/G重组菌挑取重组单克隆菌落，于^iilBMGY培养液中，30°C， 250r/min培养过夜，次日离心收集菌体，用BMMY培养液调整A600 = 1. 0，转接于:3ml BMMY 培养液中继续培养。每隔24h补加甲醇至终浓度为3%，培养至72h，收集上清。阴性对照菌株pPICz α A/G同步表达并留样。Pfs25-3E/pGAPz α A/G重组菌挑取阳性酵母重组菌转接到3mlYPD液体培养基的 20ml三角瓶中，30°C、250r/min摇床培养、表达，每隔24h取样，8000r/min离心3min，取上清-20°C保存。目的基因表达时间截止到96小时。阴性对照菌株pGAPzaA/G同步表达并留样。pfs25-3Q/pGAPZ α A/G重组菌挑取阳性酵母重组菌转接到3mlYPD液体培养基的 20ml三角瓶中，30°C、250r/min摇床培养、表达，每隔24h取样，8000r/min离心3min，取上清-20°C保存。目的基因表达时间截止到96小时。阴性对照菌株pGAPzaA/G同步表达并留样。将所有重组菌及阴性菌不同时间的表达上清留样进行电泳操作，分离胶的浓度为 10%，浓缩胶的浓度为5%，采用考马斯亮蓝作为蛋白染色剂。以pfs25标准品作为阳性对照，阴性菌表达上清作为阴性对照。所有三种重组菌在21kd的位置有目的蛋白条带，这说明Pfs25蛋白质被重组酵母菌分泌表达到培养基中，但表达量有所不同。其中pfs25/ PGAPZ α A/G重组酵母菌培养72小时的表达上清电泳结果见图3。将pfs25-3E/pGAPZ α A/G 培养 24、48、72 小时的表达上清进行 SDS-PAGE，以 pfs25 标准蛋白、pGAPZ α A/G阴性菌表达上清作对照。SDS-PAGE电转移到PVDF膜上，逐次与4B7 单克隆抗体和HRP标记兔抗鼠IgG反应，化学发光法显色观察结果。结果见图4，可见不同培养时间的表达产物与Pfs25标准蛋白有相同的特异性反应，随着培养时间延长，表达量增加。实施例4、目的基因及对照基因表达比较对照基因转化的pfs25-3Q/pGAPZ α A/G重组菌，共挑选9个克隆，分别表示为克隆 Q 2-10 ；目的基因转化的Pfs25-3E/pGAPZ α A/G重组菌共挑选8个克隆，分别表示为克隆 E2-9，进行表达分析研究。分别挑取阳性酵母重组菌转接到;3mlYPD液体培养基的20ml三角瓶中，30°C、 250r/min摇床培养、表达，72小时取样，8000r/min离心3min，取上清进行SDS-PAGE检测。 通过“Image Master Total Lab”软件(GE公司)进行的SDS-PAGE条带分析，目的基因 Pfs25-3E表达量占阳性菌株上清中分泌蛋白的70%，远高于对照基因Pfs25-3Q的16%。 具体结果见图5、表1，以图6、表2。表1、Pfs25-3Q 表达产物 SDS-PAGE 分析
不同克隆Q2Q3Q4Q5Q6Q7Q8Q9QlOpfs25含量(%)14. 312. 316. 920. 223. 227. 719. 916. 711. 3表2、Pfs25-3E突变体表达产物SDS-PAGE分析
权利要求
1.一种恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，该突变体具有SEQl所示的氨基酸序列。
2.一种适用于酵母表达的Pfs25蛋白突变体的编码基因，具有SEQ2所示的核苷酸序列。
3.一种在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白突变体的方法，包括如下步骤(1)将Pfs25蛋白突变体编码基因置于三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子的下游，构建重组酵母菌；(2)以YPD培养基培养重组酵母菌；(3)补加葡萄糖维持发酵液中的葡萄糖终浓度在0.5 lg/L范围；(4)培养M 72小时，收获培养上清，提取目的蛋白；其中所述的Pfs25蛋白突变体具有相当于Pfs25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸替换。
4.根据权利要求3的表达方法，其特征在于，所述的Pfs25蛋白突变体相当于Pfs25天然蛋白第112、165、187的天冬酰胺被谷氨酸替换。
5.根据权利要求3的表达方法，其特征在于，重组酵母菌在29.0°C、pH6. 0 4. 0、溶氧 >20%条件下发酵培养。
6.根据权利要求5的表达方法，其特征在于，发酵过程中转速约350rpm，保持通气速度 200L/h。
7.根据权利要求6的表达方法，其特征在于，发酵液中加入Antifoam204作为消泡剂。
全文摘要
本发明目的是提供一种新的恶性疟原虫Pfs25蛋白突变体，用于疟疾疫苗的开发。本发明的Pfs25蛋白突变体，相当于Pfs25天然蛋白23-193位的氨基酸序列，并且第112、165、187位的天冬酰胺突变为谷氨酸。本发明的Pfs25蛋白突变体具有与Pfs25标准蛋白相同的免疫原性，并且在毕赤酵母中高表达，目的蛋白占上清分泌蛋白的70％，因而缩短了发酵周期，简化了纯化方法。本发明还提供了表达Pfs25蛋白突变体的方法。
文档编号C12R1/84GK102286089SQ201110267829
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者刘晓, 应连芳, 杨军, 蒋琳, 陈勇, 雷清, 高雪峰 申请人:兰州生物制品研究所有限责任公司