专利名称：一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛查方法，具体的说，是一种筛查α和β地中海贫血常见点突变的方法。
背景技术：
目前，地中海贫血的常用筛查技术包括血红蛋白电泳、毛细管电泳、高效液相色谱分析(high performance liquid chromatography,HPLC)等。这些筛查技术主要是对血红蛋白组分作生化分析，均属非分子水平，它们与基因诊断的符合率均未能达到100%，在临床实践中可能造成漏诊。除毛细管电泳技术可用于筛查HbCS突变外(1)，目前国内外尚无针对非缺失型α地贫突变(特别是HbQS、HbWS)的有效筛查方法，在临床上往往导致非缺失型HbH病的漏诊。
地中海贫血的基因诊断方法主要包括裂隙PCR(Gap-PCR)用于缺失型α地贫(耗时约 5 小时)，限制性片段长度多态(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、反向点杂交(reverse dot blot, RDB)、等位基因特异性 PCR(amplificationrefractory mutation system,ARMS-PCR)用于β地贫或非缺失型α地贫(2-6)。国内商业化试剂盒是采用Gap-PCR同时检测」ΕΑ/α α,-α^/α a和-a42/a a三种缺失型突变(7，8)。RFLP是通过识别特异性序列位点进行酶切反应，方法简便成本低廉，但其局限性是只能对有限的可产生酶切位点的突变进行检测，由于不完全或部分酶切反应还会导致假阳性或假阴性结果(2)。ARMS-PCR需针对每个突变设计相应引物，每一对引物扩增条件都需优化，若需同时检测多种突变时则操作繁琐，而且也会出现假阳性或假阴性结果(3) IDB法可同时检测多种点突变，国内的商业化试剂盒可检测β地贫17种突变和非缺失型α地贫3种突变，但此法操作时间相对较长(约8小时)，步骤繁琐。这两种针对特定人群的常见突变类型的检测技术虽可实现诊断的准确性和时效性，但却无法发现新突变。高分辨熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)法是近年来发展的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法(9-11)。它是一种高效稳健的post-PCR技术，不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分析(12)。其基本原理为在PCR反应前将LC Green荧光染料与反应Buffer、引物、模板DNA混合，LC Green染料饱和加入(LC Green荧光染料对PCR不会有任何抑制作用)，然后将PCR产物(96孔板)直接放入HRM分析仪中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变(根据熔解曲线形状不同区分野生型和杂合型，根据熔解曲线Tm值不同区分野生型和纯合突变)，软件自动分型。目前HRM已广泛用于基因的突变扫描、HLA基因组配型、法医学鉴定、甲基化研究等(13-15)。HRM的技术特点包括1)检测片段范围50-1000bp ;2) 5分钟内可完成96/384孔板样品数据采集；3)直接未知杂合突变鉴定准确性100%，特异性100% ；4)直接未知纯合突变鉴定准确性96%;5)单个样品运行费用低于目前市场上任何商品化的基因突变检测仪器；6)只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，属于close-tube分析，无污染，PCR产物可以进行下游分析(10-12)。
发明内容
本发明的目的是，提供一种采用HRM技术筛查α和β地中海贫血常见点突变的方法。提供一种从基因分子水平进行α和β地中海贫血常见点突变筛查的方法。本发明的技术方案是这样的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，依次包括下述步骤⑴提取标本的基因组DNA ；⑵将PCR mix与模板DNA混合，然后加入LCGreen Plus饱和染料；(3) PCR扩增；(4) PCR结束后将产物直接放入HRM分析仪中，在60 96°C将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化·并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变，软件自动分型。上述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，所述的α地贫点突变为位于α珠蛋白基因第三外显子的HbCS点突变，HbQS点突变，HbW点突变的I个PCR扩增体系及其引物。上述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，所述的β地贫点突变为位于β珠蛋白基因三个外显子及第二内含子的6个PCR扩增体系及其引物。上述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，所述的DNA浓度要求均一化至 10-50ng/y 1，0D260/280 要求介于1. 6 2. O 之间。本发明的原理是这样的 HRM分析是在PCR反应前将PCR mix与模板DNA混合，然后加入LC Green饱和染料(LC Green荧光染料对PCR不会有任何抑制作用)，PCR结束后将产物(96孔板)直接放入HRM分析仪(LightScanner 96)中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变(根据熔解曲线形状不同区分野生型和杂合型，根据熔解曲线Tm值不同区分野生型和纯合突变)，软件自动分型。与现有技术相比，本发明具有如下优点1.本发明提供的方法筛查的准确率高，降低漏诊情况发生，缩短检测周期，简便快速、成本低廉。2.在单孔内一次性检测α地贫3种常见点突变(HbCS，HbQS，HbW)，同时实现突变筛查和基因分型，有利于提高对非缺失型α地贫特别是非缺失型HbH病的诊断率；3.对β地贫高危家系，当夫妇双方基因型已知时，可对胎儿进行快速产前诊断，大大缩短诊断时间，对于减轻孕妇的心理压力，帮助临床医生及时做出处理措施都具有重要的临床应用价值。
图1是HRM分析检测α地中海贫血三种常见点突变曲线2是HRM分析检测β珠蛋白基因(5' UTR+exon I)突变曲线3是HRM分析检测β珠蛋白基因(exon 1+intron I)突变曲线4是HRM分析检测β珠蛋白基因(exon 2)突变曲线图
图5是HRM分析检测β珠蛋白基因(intron 2)突变曲线6是β地贫产前诊断家系的HRM分析结果
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但不够对本发明的任何限制。实施例1仪器与试剂(I)仪器PCR仪(Biometra Tprofessional PCR) ;HRM分析仪(LightScanner 96, Idaho,美国)。
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(2)试剂DNA 提取试剂盒(Qiagen Mini Kit) ；PCR reagents (Buffer, Mg2+, dNTP, Taq 酶)LC Green Plus荧光染料(Idaho，美国)；α和β珠蛋白基因扩增引物(详见表I)。方法流程(I) DNA 提取外周血样采用EDTA抗凝。产前诊断标本包括羊水、绒毛、胎血等。羊水标本需3000rpm离心IOmin收集细胞，绒毛浸泡于生理盐水中。各种标本于4°C保存，48小时内提取DNA。按照Qiagen Mini Kit说明书操作，DNA浓度要求均一化至10_50ng/y 1，0D260/280要求介于1. 6 2. O之间。(2) PCR 扩增β 珠蛋白基因 PCR Mixture 共分为 4 组PCR Mixture A_F。PCR Mixture A 和 B扩增β珠蛋白基因第I外显子及第I内含子，PCR Mixture C和D扩增第2外显子及第2内含子，PCR Mixture E和F扩增第3外显子。α 珠蛋白基因 PCR Mixture 为一组PCR Mixture G。PCR反应体系DNA聚合酶使用Promega polymerase, PCR反应采用10 μ L体系，DNA模板量为10-100ng。每份DNA样本进行A-G七组反应(见表I)。PCR循环参数一致为94°C 3min, (94°C 30s, 62°C 30s) X 40cycles, 94°C 30s, 25°C 30s, 4°C forever 反应在Biometra Tprofessional PCR 仪上进行。表IHRM分析引物序列表
权利要求
1.一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，其特征在于，依次包括下述步骤(1)提取标本的基因组DNA；(2)将PCRmix与模板DNA混合，然后加入LC Green Plus饱和染料；(3)PCR 扩增；(4)PCR结束后将产物直接放入HRM分析仪中，在60 96°C将PCR扩增产物进行变性， 在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变，软件自动分型。
2.根据权利要求1所述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，其特征在于，所述的α地贫点突变为位于α珠蛋白基因第三外显子的HbCS点突变，HbQS点突变，HbW点突变的I个PCR扩增体系及其引物。
3.根据权利要求1所述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，其特征在于，所述的β地贫点突变为位于β珠蛋白基因三个外显子及第二内含子的6个PCR扩增体系及其引物。
4.根据权利要求1所述的一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，其特征在于，所述的DNA浓度要求均一化至10-50ng/y 1，0D260/280要求介于1. 6 2. O之间。
全文摘要
本发明公开一种筛查α和β地中海贫血点突变的方法，旨在提供一种简便快速、成本低廉、准确率高的筛查α和β地中海贫血点突变的方法；其技术要点是(1)提取标本的基因组DNA；(2)将PCR mix与模板DNA混合，然后加入LC Green Plus饱和染料；(3)PCR扩增；(4)PCR结束后将产物直接放入HRM分析仪中，在60～96℃将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯合突变，软件自动分型。
文档编号C12Q1/68GK102994615SQ20111026876
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者廖灿, 李茹 申请人:广州市妇女儿童医疗中心