专利名称：利用微流控芯片筛选蛋白质的核酸适体的方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸适体的筛选方法，尤其涉及一种利用特定装置筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法。
背景技术：
核酸适体(aptamer)，也称为核酸适配子，是经过一种新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，其是从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异性结合靶物质的单链寡聚核苷酸，可以是DNA也可以是RNA，长度一般为25 60 个核苷酸。核酸适体的出现，打破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸结构的多样性，可使核酸适体高效、特异地结合各种靶分子。核酸适体具有易合成、易修饰、易存储等优点，可广泛用于蛋白质的分析检测、生物传感器、分子开关的开发、医学诊断治疗等方面。但是由于常规的SELEX方法中的筛选轮数一般为8 20轮，有时甚至需要30轮才能筛选出一条可以应用的核酸适体，所以目前已筛选出的核酸适体种类较少，只有几百种。因此，为了获得更多种核酸适体，有必要提高其筛选效率。微流控芯片，也称芯片实验室(Lab-on-a-chip )，是利用微电子机械系统技术 (Micro-electro-mechanical Systems,MEMS)在玻璃、硅和有机高分子聚合物等基片表面， 构建微管、微池、微泵等分析单元和系统，或基于芯片毛细管电泳技术，以实现样品进样、生物和化学反应、预浓缩、分离和检测等功能，微流控芯片具有快速、高效、高通量、低成本、低样品量、可批量分析等优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种通用性强、筛选时间短、筛选效率高、筛选效果好的利用微流控芯片筛选蛋白质的(特异性)核酸适体的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，包括以下步骤
(1)优化核酸文库将预先设定的起始核酸文库先与非靶标蛋白质孵育，得到用于靶标蛋白质核酸适体筛选的优化核酸文库；
(2)修饰微珠将所述靶标蛋白质先与微珠孵育，将修饰有靶标蛋白质的微珠置入一微流控芯片通道内；
(3)初筛将所述优化核酸文库通入所述微流控芯片通道内，该通道内的微珠上修饰的靶标蛋白质与所述优化核酸文库中部分核酸分子结合，经过在该微流控芯片通道内的冲洗、洗脱，得到与所述靶标蛋白质结合的初筛核酸文库；
(4)纯化将上述得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库；
(5)循环以上述得到的次一级核酸文库替代所述起始核酸文库并重复上述的步骤 (1) 步骤(4)，直至得到包含有与所述靶标蛋白质高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库。上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，所述靶标蛋白质可以为血液中的各种常规蛋白质。根据我们的实验结果，所述血液中的常规蛋白质优选为肌红蛋白或C反应蛋白。上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，优选的所述起始核酸文库主要包含70 80个碱基的DNA序列，该DNA序列两端优选为15 20个碱基的弓I物序列，该DNA序列中段优选为40个碱基的随机序列，所述起始核酸文库容量优选在 IO14以上。上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，所述非靶标蛋白质优选是指与所述靶标蛋白质同族或相似的蛋白质，或者是与所述靶标蛋白质在同一环境或体系中的蛋白质。上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，优选的，所述微流控芯片的通道两端分别设有进样口和出样口，所述通道上设有收缩段以形成一用于阻挡微珠通过的狭窄通道。所述通道的宽度优选在150 μ m以上，通道的高度优选在50 μ m以上，所述收缩段的高度优选为IOym 18μπι，所述微珠(优选聚苯乙烯微珠)的粒径优选为 20 μ m 40 μ m。上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质核酸适体的方法中，步骤(2)中的微珠孵育后可优选用封闭剂封闭，所述封闭剂优选为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或脱脂奶粉。与现有技术相比，本发明的优点在于在本发明的方法中，靶标蛋白质会通过亲疏水作用首先吸附固定在聚苯乙烯微珠表面，避免了通过共价作用固定对蛋白质构象的影响；而在本发明的筛选过程中，由于创造性地借助了微流控芯片这一全新的平台，使核酸文库和靶标蛋白质的结合在流动的环境下进行，一定的流速和压力提高了筛选强度，减少了非特异性序列与靶标蛋白质的吸附。与常规方法相比，本发明的筛选方法不仅减少了循环的轮数，而且大大缩短了筛选时间，提高了筛选效率。
图1为本发明实施例中利用微流控芯片-SELEX技术筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的工艺流程图。图2为本发明实施例1中以肌红蛋白为靶标蛋白质的筛选过程中每轮表面等离子共振(SPR)信号的变化图。图3为本发明实施例1中筛选出的肌红蛋白的核酸适体的解离常数Kd的测定。图4为筛选出的肌红蛋白的核酸适体的特异性。图5为本发明实施例2中以C反应蛋白为靶标蛋白质筛选出产物的解离常数Kd的测定。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例1 与肌红蛋白特异性结合的核酸适体的筛选。
一种如图1所示的本发明的利用微流控芯片筛选肌红蛋白核酸适体的方法，包括以下步骤
1.优化核酸文库
1.1设计起始核酸文库起始核酸文库容量在IO14以上，设计合成两端包含20个核苷酸、中间包含40个核苷酸的随机核酸序列文库如下
5’ - CCGTTGCTACCGAGTGTCTG-N4(i-ATGAAGAAAGAGGAACGGGC-3，。1. 2优化起始核酸文库将合成好的200pmol的单链起始核酸文库溶于结合缓冲液(20mmol/L Hepes,120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2, pH 7. 35)中，在其中进行热变性处理，95°C加热5min，在冰上放置lOmin，然后室温下放置 IOmin ；将经过处理好的单链DNA起始核酸文库先置于修饰了 HSA的M孔板中25°C孵育lh， 收集未与HSA结合的余液，即为优化核酸文库。2.修饰微珠
2.1取0.5mL直径为25μπι的聚苯乙烯微珠置于1.5mL离心管中，移走上清，用硼酸缓冲液(0. lmol/L硼酸，pH为8. 5)冲洗3次。2.2取30yg 40yg的肌红蛋白加入步骤2. 1的微珠中，25°C过夜孵育，用硼酸缓冲液冲洗2次后加入储存缓冲液(0. lmol/L PBS, 10mg/mL BSA，0· 1% NaN3, 5%甘油，pH为
7.4) 4°C保存(本实施例中由于靶标蛋白质分子量较小，可不做封闭处理)。2. 3准备一如图1所示的微流控芯片，微流控芯片的通道两端分别设有进样口和出样口，通道中间上设有收缩段以形成一用于阻挡微珠通过的狭窄通道；该微流控芯片的通道宽度为200 μ m,该通道的高度为70 μ m,收缩段的高度为15 μ m,将修饰好的微珠滴于微流控芯片的进样口，通过微量注射泵从出样口将微珠吸入芯片，并固定于芯片的狭窄通道处。3.初筛
将步骤1中获得的优化核酸文库通入上述微流控芯片的通道内，控制流速0. 5 μ L/min (通过微量注射泵控制流速)，该通道内的微珠上修饰的肌红蛋白与优化核酸文库中的部分核酸分子结合，之后用冲洗缓冲液(结合缓冲液，0.05% Tween 20)以流速2 μ L/min冲洗 30min，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，4mol/L 异硫氰酸胍，lmmol/L DTT, pH 为
8.3)以流速2 μ L/min冲洗30min，经过在该微流控芯片通道内的冲洗、洗脱后，收集得到与肌红蛋白结合的初筛核酸文库。4.纯化
将步骤3收集的初筛核酸文库中的单链DNA进行PCR反应； 引物 1 :5，-CCGTTGCTACCGAGTGTCTG-3，； 引物 2 :5，-Biotin-GCCCGTTCCTCTTTCTTCAT-3’ ； PCR反应条件如下
94°C预变性5min，94°C变性30s, 60. 5°C退火30s，72°C延伸30s，扩增12个循环，最后 72°C延伸 7min。将PCR扩增后的产物通过预装有链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠的亲和柱分离带生物素标记的产物，然后用0. 2mol/L的NaOH进行解链，经脱盐色谱纯化后用作下一轮筛选的单链次一级核酸文库。
5.循环
以步骤(4)得到的次一级核酸文库替代优化核酸文库并重复上述的步骤2 步骤4，在之后的筛选过程中，逐步增大冲洗时的流速来增强筛选强度，并通过sra仪检测每轮的信号变化来确定筛选终点，从结果可以看出，随着筛选轮数的增加，在加入相同浓度的筛选产物后，SI^R信号也不断的增加，说明每轮的筛选的核酸适体相比前一轮的产物都增加了与肌红蛋白的亲和力(见图2)；经过4轮循环筛选后，经克隆测序分析后得到最终选择的核酸适体序列如下
CCGTTGCTACCGAGTGTCTGTGGTGGGATGCCTAGAACAACTTCATGTCACCTTTGGCAAATGAAGAAAGAGG AACGGGCo最后对本实施例筛选所得的上述序列的核酸适体与肌红蛋白的解离常数Kd的测定及特异性进行考察。采用SI^R仪检测，以结合缓冲液为工作液，按以下步骤进行
(1)首先将20μ L 0. 5 μ g/μ L的肌红蛋白滴在金膜表面修饰浊，然后20 μ L 200nmol/ L的非特异性DNA序列进行封闭，使金膜空位点对DNA的非特异性吸附饱和；用结合缓冲液冲洗后，按浓度由低到高依次加入3. 125nmol/L、6. 25nmol/L、12. 5nmol/L、25nmol/L、 50nmol/L、1 OOnmo 1/L浓度梯度的DNA溶液各20 μ L，每个浓度分别孵育30min，DNA溶液均先热变性处理；将所得的结果用sigma plot软件进行作图，用公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合计算出核酸适体的解离常数Kd，得到所筛选序列的解离常数Kd为9. 62nmol/L (见图3)；
(2)再将20μ L 0. 5 μ g/ μ L的肌红蛋白和20 μ L 0. 1%的HSA分别滴在金膜表面修饰 2h，用20 μ L 200nmol/L的非特异性DNA序列进行封闭后，分别加入20 μ L IOOnmo 1/L的筛选所得的核酸适体序列，如结果所示，在相同的浓度下，核酸适体与肌红蛋白反应的信号是与HSA反应信号的10倍以上(见图4)。实施例2 与C反应蛋白特异性结合的核酸适体的筛选。一种如图1所示的本发明的利用微流控芯片筛选肌红蛋白核酸适体的方法，包括以下步骤
1.优化核酸文库
1.1设计起始核酸文库起始核酸文库容量在IO14以上，设计合成两端包含16个核苷酸、中间包含40个核苷酸的随机核酸序列文库如下
5’ -GGCAGGAAGACAAACA-N4(i-TGGTCTGTGGTGCTGT-3，。1. 2优化起始核酸文库将合成好的200pmol的单链起始核酸文库溶于结合缓冲液(20mmol/L Hepes,120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2, pH 7. 35)中，在其中进行热变性处理，95°C加热5min，在冰上放置lOmin，然后室温下放置 IOmin ；将经过处理好的单链DNA起始核酸文库先置于修饰了 BSA的M孔板中25°C孵育lh， 收集未与BSA结合的余液，即为优化核酸文库。2.修饰微珠
2.1取0.5mL直径为25μπι的聚苯乙烯微珠置于1.5mL离心管中，移走上清，用硼酸缓冲液(0. lmol/L硼酸，pH为8. 5)冲洗3次。2.2取30yg 40yg的C反应蛋白加入步骤2. 1的微珠中，25°C过夜孵育，移走上清后加入1% BSA 25°C孵育2h，用硼酸缓冲液冲洗2次后加入储存缓冲液(0. lmol/L PBS, 10mg/mL BSA，0. 1% NaN3, 5% 甘油，pH 为 7. 4) 4°C保存。
2. 3准备一如图1中所示的微流控芯片，微流控芯片的通道两端分别设有进样口和出样口，通道中间上设有收缩段以形成一用于阻挡微珠通过的狭窄通道；该微流控芯片的通道宽度为200 μ m,该通道的高度为70 μ m,收缩段的高度为15 μ m,将修饰好的微珠滴于微流控芯片的进样口，通过微量注射泵从出样口将微珠吸入芯片，并固定于芯片的狭窄通道处。3.初筛
将步骤1中获得的优化核酸文库通入上述微流控芯片的通道内，控制流速0. 5 μ L/min (通过微量注射泵控制流速)，该通道内的微珠上修饰的肌红蛋白与优化核酸文库中的部分核酸分子结合，之后用冲洗缓冲液(结合缓冲液，0.05% Tween 20)以流速2 μ L/min冲洗 30min，最后用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，4mol/L 异硫氰酸胍，lmmol/L DTT, pH 为 8. 3)以流速2 μ L/min冲洗30min，经过在该微流控芯片通道内的冲洗、洗脱后，收集得到与 C反应蛋白结合的初筛核酸文库。4.纯化
将步骤3收集的初筛核酸文库中的单链DNA进行PCR反应； 弓丨物 1:5， - GGCAGGAAGACAAACA-3，； 弓L 2 :5’ -Biotin- ACAGCACCACAGACCA-3‘； PCR反应条件如下
94 °C预变性5miη，94 °C变性30s，62 °C退火30s，72 °C延伸30s，扩增14个循环，最后 72°C 延伸 7min。将PCR扩增后的产物通过预装有链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠的亲和柱分离带生物素标记的产物，然后用0. 2mol/L的NaOH进行解链，经脱盐色谱纯化后用作下一轮筛选的单链次一级核酸文库。5.循环
以步骤(4)得到的次一级核酸文库替代优化核酸文库并重复上述的步骤2 步骤4， 在之后的筛选过程中，逐步增大冲洗时的流速来增强筛选强度，经过6轮循环筛选后，通过 SPR仪检测了筛选核酸适体产物的解离常数Kd为3. 32nmol/L (见图5)。
权利要求
1.一种利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，包括以下步骤(1)优化核酸文库将预先设定的起始核酸文库先与非靶标蛋白质孵育，得到用于靶标蛋白核酸适体筛选的优化核酸文库；(2)修饰微珠将所述靶标蛋白质先与微珠孵育，将修饰有靶标蛋白质的微珠置入一微流控芯片通道内；(3)初筛将所述优化核酸文库通入所述微流控芯片通道内，该通道内的微珠上修饰的靶标蛋白质与所述优化核酸文库中部分核酸分子结合，经过在该微流控芯片通道内的冲洗、洗脱，得到与所述靶标蛋白质结合的初筛核酸文库；(4)纯化将上述得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库；(5)循环以上述得到的次一级核酸文库替代所述起始核酸文库并重复上述的步骤 (1) 步骤(4)，直至得到包含有能与所述靶标蛋白质特异性结合的核酸适体的核酸文库。
2.根据权利要求1所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述靶标蛋白质为血液中的常规蛋白质。
3.根据权利要求2所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述血液中的常规蛋白质包括肌红蛋白或C反应蛋白。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质核酸适体的方法，其特征在于，所述起始核酸文库主要包含70 80个碱基的DNA序列，该DNA序列两端为15 20个碱基的引物序列，该DNA序列中段为40个碱基的随机序列，所述起始核酸文库容量在 IO14以上。
5.根据权利要求1、2或3所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述非靶标蛋白质是指与所述靶标蛋白质同族或相似的蛋白质，或者是与所述靶标蛋白质在同一环境或体系中的蛋白质。
6.根据权利要求1、2或3所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述微流控芯片的通道两端分别设有进样口和出样口，所述通道上设有收缩段以形成一用于阻挡微珠通过的狭窄通道。
7.根据权利要求6所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述通道的宽度在150 μ m以上，通道的高度在50 μ m以上，所述收缩段的高度为 10 μ m 18 μ m，所述微珠的粒径为20 μ m 40 μ m。
8.根据权利要求1、2或3所述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，微珠孵育后用封闭剂封闭，所述封闭剂为牛血清白蛋白、 人血清白蛋白或脱脂奶粉。
全文摘要
本发明公开了一种利用微流控芯片筛选蛋白质的核酸适体的方法，包括以下步骤将预先设定的起始核酸文库先与非靶标蛋白质孵育，得到优化核酸文库；然后将靶标蛋白质先与微珠孵育，将修饰有靶标蛋白质的微珠置入一微流控芯片通道内；再将优化核酸文库通入微流控芯片通道内，经过冲洗、洗脱，得到初筛核酸文库；对初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过亲和柱分离，变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库；以次一级核酸文库替代起始核酸文库并重复前述步骤，直至得到含目标核酸适体的核酸文库。本发明的方法具有通用性强、筛选时间短、筛选效率高、筛选效果好等优点。
文档编号C12N15/10GK102321616SQ20111027301
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者江锐, 王柯敏, 王青, 羊小海, 邢煜骞 申请人:湖南大学