专利名称：一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其酶产品和生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，更确切说是一种高效表达β -甘露聚糖酶的芽孢杆菌及其酶产品和生产方法。
背景技术：
β -甘露聚糖酶是一类能够水解含有β -葡萄糖苷键和β -甘露糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶，甘露聚糖主要存在于魔芋胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、田菁胶中，主要成分是葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，它们构成了植物半纤维素的第二大组分，水解这些植物中甘露聚糖的酶产品就是β-甘露聚糖酶。
自上世纪80年代Akio. T等美国科学家首次发表甘露聚糖酶的研究 ^ 5fe(Akino Τ, Nakmura N, Horkoshi K. et al. Characterization of three
β -mannanase of an alkalophilic Bacillus sp. [J].Agric Biol Chem. 1988. 52773-779)，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究就引起人们极大的关注。最近的报道是，李剑芳等(β-甘露聚糖酶高产菌株选育及产酶条件的研究，食品与发酵工业，第 31卷第9期.2005)，张敏等(野皂荚多糖胶制备半乳甘露低聚糖的研究，食品工业斜技， Yol. 29, No. 09，2008)，王玲玲等(酶解法制备低相对分子质量胡芦巴半乳甘露聚糖及其产物的表征，林产化学与工业，第四卷第2期，Apr. 2009)，吴长菲等(魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究，生物技术通报2010年卷01期)。还有相关专利文献CN 1766098 A, 2006. 5. 3; CN 1739949 A, 2006. 6. 28; CN 100516196 C，2007. 7. 22。在上述的一些研究中，或是存在酶活力不高，底物浓度低，成本高，缺乏工业生产的基础(对半乳甘露聚糖而言尤其如此)；或是水解过程中加碱、加酸，给后处理工艺带来困难，还不利于环保。因此，水解魔芋胶和瓜尔豆胶中甘露聚糖的β -甘露聚糖酶的制取方法仍然面临很多技术难题。而这也是本发明创新技术的起点。
发明内容
本发明的目的是利用TQK菌株，通过UV (紫外线诱变)、NTG (亚硝基肌诱变)、微波诱变3种方法重复使用2次的复合诱变，诱导培养能高效表达β -甘露聚糖酶的芽孢杆菌TQBm菌株，及其发酵生产高效能甘露聚糖酶产品的生产方法，从而能高效经济地转化生产甘露低聚糖。使用的微生物本发明涉及的芽孢杆菌TQBm，它具有高效表达半纤维素酶的特性该菌株于2011年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址.中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No :M 211147 (Bacillus subtilis TQBm)。芽孢杆菌TQBm菌株的菌学特性
a、形态特征单个细胞0.7 0. 8X2 3微米、着色均勻。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0. 6 0. 9X1. 0 1. 5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。b、生理生化特征菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基中生长时，形成皱醚；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在半纤维素的诱导下产生半纤维素酶，在低聚甘露糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。本发明是这样实现的。从中国典型培养物保藏中心取得的TQK菌株(保藏号为 CCTCC No =M 207129)为出发菌，先采用UV (紫外线诱变)，条件是紫外灯功率15 30w， 照射距离20 50cm，照射时间1 Smin ；再采用NTG (亚硝基胍诱变)，条件是NTG浓度 1 ;3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理90 120min ；最后采用微波诱变，条件是家用微波炉，2450MHz，最小功率80w，最大功率800w，培养皿不加盖、快速冰上冷却，最佳处理时间为50s。按上述3种复合诱变方法及顺序重复使用2次后，将菌种接种在含有0. 1 0. 5%的刚果红平板培养基中，30 35°C，诱导培养M 48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为琼脂1. 5 2. 5%，魔芋胶酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，(或者瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，)以此对菌种进行适应性驯化和有效诱导，胰蛋白胨0. 5 2 %，酵母浸粉0. 5 2%，NaCl 0. 1 0. 5%,刚果红0. 1 0. 5%。选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力培养基配方中碳源用魔芋胶酶解物的达到1600 μ/ml，培养基配方中碳源用瓜尔豆胶酶解物的达到950 μ /ml。选取优良菌株进行稳定传代3代，最后得到高产半纤维素酶斜面菌株。将该菌株命名为TQBm，于4°C冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No M 211147 (简称 TQBm)。发酵产酶工艺包括如下步骤
1、一级液体培养即从斜面到500ml三角瓶的放大培养，接种量为TQBm斜面菌一环， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5条件下，在液体培养基中培养12 M小时。培养基配方按质量百分比计魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，(或者瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Βχ>1· 5 5. 0%)，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，Na2HPO4 12Η20 1 3%, KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉 1 5%,玉米渣 1 5%，其余为水，加水至500ml。2、7L小罐发酵产酶(专用于酶解魔芋胶)
以2 5%的接种量接种，培养条件35 37 "C, 300 500r/min, pH6. 5 7. 5，培养 18 M小时，培养基配方为魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>5 15%，无机盐复合成份1. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%。发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30% 80% ；培养结束后，DNS法测定酶液的活力，平均酶活力达到2000 μ /ml。所述无机盐复合成份为Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5 ；
最佳配方魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，无机盐复合成份2. 5%，酶母浸粉1. 0%， 胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%;最佳培养条件35士1°0，400171^11，？!17.0;最佳培养22小时； 通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65%。
3、7L小罐发酵产酶(专用于酶解瓜尔豆胶)
除培养基配方中的碳源为瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Bx>5 15%外，其它条件与第2步相同，培养结束后，DNS法测定酶液的活力，平均酶活力达到1350μ/πι1。4、酶的纯化
发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用0. 1 μ m的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率> 85%。5、β —甘露聚糖酶于低温0 4°C下贮存。本发明与现有技术相比具有以下突出特点 1、三重复合诱变技术构建出高效产酶菌株
本发明采用UV+ NTG+微波诱变的复合诱变技术，并按相同顺序重复诱变2次，其复合诱变的协同效应大大增强，比通常的2种复合诱变技术的效果提高了 33%。筛选出新型的 TQBm菌株，可高效表达β -甘露聚糖酶，方法简便，效率高。2、新碳源用作产酶诱导物提高了酶作用效率
本发明在发酵过程中的碳源分别采用魔芋胶和瓜尔豆胶的酶解物(糖度ΙΟΒχ，粘度 260 观0 mPa. s，估算分子量为8，000 20，000)代替高分子魔芋胶和瓜尔豆胶分别进行诱导产酶，降低了培养基的粘度，使菌种能够更充分吸收碳营养素。尤其重要的是，用较小分子的碳营养素作有效诱导，酶分子的结构也发生了有益变化，大大提高酶作用的效率，特别是提高了底物浓度酶作用于魔芋胶时，底物浓度可达到创记录的15 20%，Iml酶液转化30g魔芋胶，可降低能耗10 15% ；而酶作用于瓜尔豆胶时，底物浓度可达到10 15%， Iml酶液转化15g瓜尔豆胶，可降低能耗15 20%，从而在全球范围内首次使酶解瓜尔豆胶的工业规模生产成为可能，远远高于目前的研究水平。3、发酵产出的酶液收得率高
由于培养基中的碳营养素是用相对小分子的糖物质，菌种发酵产酶率提高了 8 10%， 再经精细化的酶液纯化操作，酶收得率可达到85%，技术经济效果显著。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。实施例1 高效表达β -甘露聚糖酶的TQBm菌株选育。从中国典型培养物保藏中心保藏取得的TQK菌株(保藏号为CCTCC No =M 2071 )为出发菌，先采用UV (紫外线诱变)，条件是紫外灯功率15 30w，照射距离20 50cm，照射时间1 8min;再采用NTG (亚硝基胍诱变)，条件是NTG浓度1 ;3mg/ml， 在pH6. 0的tris缓冲液中，处理90 120min ；最后采用微波诱变，条件是家用微波炉， M50MHz，最小功率80w，最大功率800w，培养皿不加盖、快速冰上冷却，最佳处理时间为 50s。按上述3种复合诱变方法及顺序重复使用2次后，将菌种接种在含有0. 1 0. 5%的刚果红平板培养基中，30 35°C，诱导培养M 48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为琼脂1. 5 2. 5%，魔芋胶酶解物〈糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Βχ>1. 5 5. 0%，以此对菌种进行适应性驯化和有效诱导)，胰蛋白胨0. 5 2 %，酵母浸粉0. 5 2%, NaCl 0. 1 0. 5%,刚果红0. 1 0. 5%。选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力培养基配方中碳源用魔芋胶酶解物的达到1600 μ/ml，培养基配方中碳源用瓜尔豆胶酶解物的达到950 μ /ml。实施例2:发酵生产β -甘露聚糖酶——用于酶解魔芋胶
(1)将TQfei菌株(保藏号为CCTCC No: Μ2011147)用划线接种在含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨1. 5%，氯化钠0. 5 %，魔芋胶酶解物(糖度IOBx) 5. 0%，琼脂2. 0%的平面培养基上， 33°C温度下培养M小时后使用。(2)—级液体培养用500ml的三角瓶装150ml含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨 1. 5%,氯化钠0. 5%，魔芋胶酶解物(糖度10Bx)10. 0%的液体培养基，10磅灭菌20分钟，接种一环，34°C摇床上震荡Q60r/min)培养M小时。(3)用7升发酵罐装5升含酵母浸粉，胰蛋白陈，魔芋胶酶解物(糖度ΙΟΒχ)，无机盐复合成份，豆粕粉、玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子150ml于35°C 下通气搅拌18 M小时出罐放料。(4)低温离心分离酶液用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速在4 V 条件下离心15 20分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所说的酶液，置0 4°C低温保存备用。此酶液专用于酶解魔芋胶，称为酶解魔芋胶专用酶液BM— I。(5) DNS 法检测发酵液酶活力。在 30 ;35°C，200 300r/min，ρΡΗ6· 5 7. 5条件下，酶活可达2000 μ/ml。实施例3:发酵生产β -甘露聚糖酶——用于酶解瓜尔豆胶
(1)将TQfei菌株(保藏号为CCTCC No: Μ2011147)用划线接种在含酵母浸粉1. 0%，胰蛋白胨1. 0%，氯化钠0. 5 %，瓜尔豆胶酶解物(糖度10Βχ)5. 0%，琼脂2. 0%的平面培养基上， 33°C温度下培养M小时后使用。(2)—级液体培养用500ml的三角瓶装150ml含酵母浸粉1. 5%，胰蛋白胨 1. 5%,氯化钠0. 5%，瓜尔豆胶酶解物(糖度10Bx)10. 0%的液体培养基，10磅灭菌20分钟， 接种一环，34°C摇床上震荡Q60r/min)培养M小时。(3)用7升发酵罐装5升含酵母浸粉，胰蛋白陈，半纤维素之瓜尔豆胶，无机盐复合成份，豆粕粉、玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子150ml于35°C下通气搅拌18 M小时出罐放料。(4)低温离心分离酶液用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速在4 V 条件下离心15 20分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所说的酶液，置0 4°C低温保存备用。(5) DNS 法检测发酵液酶活力。在 30 !35°C，200 300r/min，ρΡΗ6· 5 7. 5条件下，酶活可达1350μ/ml，此酶液专用于酶解瓜尔豆胶，称为酶解瓜尔豆胶专用酶液 BM—II。此种BM— II酶液还可以高效酶解槐豆胶，田菁胶。酶活的测定，采用DNS法测定酶液的活力。1、DNS法测酶活以0. 5%魔芋胶或瓜尔豆胶为底物，50°C水浴保温反应lOmin， 加入DNS试剂，沸水浴中显色lOmin，用纯水稀释定容到25ml。用721分光光度计，在520 nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含量，再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为在50°C、pH6.0条样下，每分钟生成Iymol相当于D—甘露糖(D—marmose)的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。2、酶活计算公式为
公式 X = AX lml/VX FX 1 / TX 1000 / 180 式中X 酶活力，ymol /1111^:0—甘露糖生成量，1^。3、降解测粘法酶生产过程中，检验酶液质量的另一方法是1ml酶液，于50°C， pH7. 0左右，将10 20g半纤维素(底物浓度10 20%)降解成低聚甘露糖所需时间为2 4小时，降解液粘度为60 120mPa. s。该方法和生产实践联系密切。
权利要求
1.一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtill ) TQBm，其保藏号为 CCTCC No: M 211147。
2.—种甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌TQfei按下述步骤发酵生产的a、一级液体培养即从斜面到500ml三角瓶的放大培养，接种量为TQBm斜面菌一环， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5条件下，在液体培养基中培养12 M小时，培养基配方按质量百分比计魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉 0. 5 2%，Na2HPO4 12H20 1 3%，KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，其余为水，加水至500ml ；b、7L小罐发酵产酶以2 5%的接种量接种，培养条件35 37°C, 300 500r/ min, pH6. 5 7. 5，培养18 M小时，培养基配方为魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>5 15%， 无机盐复合成份1. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5% ；发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30% 80% ；所述无机盐复合成份为 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5 ；C、酶的纯化发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用0. 1 μ m的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率> 85% ；d、β -甘露聚糖酶于低温0 4°C下贮存；此酶液称为酶解魔芋胶专用酶液BM— I。
3.根据权利要求2所述的一种甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b)步骤中，最佳配方魔芋胶酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，无机盐复合成份2. 5%，酶母浸粉1. 0%， 胰蛋白胨1.0%，玉米渣3%;最佳培养条件35士1°0，400171^11，？!17.0;最佳培养22小时； 通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65% ；所述无机盐复合成份为 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5。
4.一种甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于是使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌TQfei按下述步骤发酵生产的a、一级液体培养即从斜面到500ml三角瓶的放大培养，接种量为TQBm斜面菌一环， 在30 ;35°C，200 300r/min, pH6. 5 7. 5条件下，在液体培养基中培养12 M小时，培养基配方按质量百分比计瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Bx>2. 5 5. 0%，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉 0. 5 2%，Na2HPO4 12H20 1 3%，KH2PO4 0. 1 0. 5%, NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，其余为水，加水至500ml ；b、7L小罐发酵产酶以2 5%的接种量接种，培养条件35 37°C, 300 500r/ min,pH6. 5 7. 5，培养18 M小时，培养基配方为瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Bx>5 15%， 无机盐复合成份2. 5 3. 5 %，胰蛋白胨0. 5 2%，酵母浸粉0. 5 2%，豆粕粉1 5%，玉米渣1 5%，通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为 30% 80% ；C、酶的纯化发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用0. 1 μ m的微滤膜对粗滤液进行纯化处理，进一步除去残存的微量菌体，再用 6000D超滤膜进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶收得率> 85% ；d、β -甘露聚糖酶于低温0 4°C下贮存；此酶液称为酶解瓜尔豆胶专用酶液BM—II。
5.根据权利要求4所述的一种β-甘露聚糖酶酶的制取方法，其特征在于在b)步骤中，最佳配方瓜尔豆胶酶解物 < 糖度10Bx>10. 0%，无机盐复合成份2. 5%，酶母浸粉 1. 0%，胰蛋白胨1. 0%，玉米渣3% ；最佳培养条件35 士 rC,400r/min,pH7. 0 ；最佳培养22 小时；通入压缩空气，发酵旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为65% ；所述无机盐复合成份为 Na2HPO4 12H20 1 3%、KH2PO4 0. 1 0. 5%、NaCl 0. 2 0. 5%, NH4Cl 0. 2 0. 5。
全文摘要
本发明提出了一种以枯草芽孢杆菌TQK为出发菌，采用UV+NTG+微波诱变3种方法重复使用2次的复合诱变技术，诱导培养能高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌TQBm菌株，其保藏号为CCTCCNo:M211147，用该TQBm菌株发酵生产高效能β-甘露聚糖酶及酶产品BM--Ⅰ、BM--Ⅱ。在优化产酶条件下可发酵得到平均酶活力为1000～2000μ/ml的高效能β-甘露聚糖酶，1ml酶液可转化10～20g甘露聚糖，底物浓度可达到10～20%。通过本发明培养出的TQBm菌株产酶量大，酶活力高，使用该酶产品能高效经济地水解魔芋、瓜尔豆、槐豆、田菁等植物中的甘露聚糖，生产甘露低聚糖。
文档编号C12N1/20GK102373168SQ20111030471
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者万霞, 彭冬秋, 汪修武, 钱乾, 钱金宏, 黄云琦, 黄代勇, 黄芳 申请人:武汉东方天琪生物工程有限公司