专利名称：用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。
背景技术：
棉花是我国重要的战略物质，它不仅涉及2-3亿棉农的切身利益，还关系到流通领域几十万人、纺织工业1900万人的就业问题。但棉花病害是制约棉花生产和品质的重要因素，我国常年因病害造成的损失达15% 20%。
引致棉花病害发生的病原物包括多种真菌、细菌、放线菌等，其中尤以真菌和细菌病原所致病害最重。一般认为棉花种子、病株残体、棉铃壳和棉籽饼等可携带多种微生物， 是传播多种棉花病害的主要途径，而忽略了棉花纤维是否带菌的问题。
我国每年需进口 600多万吨原棉以满足国内需求。如果棉花纤维上携带病原菌， 一些病原菌将通过原棉进口进入中国，对我国的棉花生产带来巨大威胁。如棉花枯萎病、黄萎病均是由真菌弓丨起的病害。我国引起枯萎病的真菌生理小种和美国的生理小种有明显差异，引起黄萎病的病原菌大丽轮枝菌致病力也存在较大差异，如美国的黄萎病病原菌分为落叶型T-1和非落叶型SS-4两个生理小种，前一种的致病力比后一种强10倍。
因此建立棉花纤维上携带的微生物的检测方法，对于加强病害检疫、杜绝国外病原微生物的侵入，确保我国棉花生产安全具有重要意义。
我国现有的微生物检测方法是对土壤微生物的检测，该检测方法包括培养基制备、微生物的分离计数、土壤悬液的制备、微生物培养和微生物数量的统计分析(见《土壤微生物研究法》第54-58页记载的“稀释平板法”，中国科学院南京土壤研究所微生物室编著，1985年，科学出版社出版)。在土壤悬液的制备方面具体操作为称取IOg 土样，放入 IOOml无菌水中，置于200rpm的摇床上震荡·半个小时，得到KT1 土壤悬液。准确吸取Iml IO-1 土壤悬液注入9ml无菌水中并反复吹吸，得到10_2 土壤稀释液，·照此方法依次稀释制备 10_3-10_n稀释度的土壤稀释液。吸取Iml 10_4 土壤稀释液接种细菌培养基、吸取Iml 10_2 土壤稀释液接种放线菌培养基、吸取10_4 土壤稀释液接种真菌培养基并各重复3次。但是该方法只适于制备土壤悬液，不能用于棉花纤维上携带的微生物的检测，原因是(I) 土壤和棉花纤维的密度大小差距较大，土壤菌悬液制备时需要的土壤重量较大，而相同质量的棉花纤维体积太大，具体操作起来不方便(我们在实验中发现，O. 5g棉花纤维就能完全吸干 IOml无菌水)；(2)对原始母液的稀释倍数也不一样，因为土壤的重量大，菌悬液的稀释倍数可稍微高一些，而棉花纤维的重量小，如果稀释倍数太高，其中某些含量较少的菌种会因不在菌落培养数之内而造成误差甚至出现错误，而如果稀释倍数太小，相对重量而言，无菌水太少不能完全浸没棉花纤维，引起棉花纤维上微生物不能完全脱离纤维，造成实验错误。
我国对棉花纤维上携带的微生物的研究较少，检测的方法尚属空白。因此亟需建立棉花纤维上携带的微生物的检测方法。发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。
本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法包括以下步骤
(I)称取一定量的待测棉花纤维样品，计算所述棉花纤维样品的样品含水率；
(2)称取与步骤(I)中的所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维，并用无菌水浸泡，摇床培养1-3小时(优选2小时)，得到浸泡液母液；
(3)取部分所述浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到稀释液；
(4)分别将O. 1-0. 3ml (优选O. 3ml)稀释液接种在不同的选择性培养+基上，并在 280C -30°C的温度下进行培养；
(5)根据所述稀释液在所述不同的选择性培养基上的生长情况，鉴定所述棉花纤维上携带的微生物的种类；以及
(6)记录选择性培养基上的菌落数，然后求平板上菌落数的平均值，并根据下式计算所述棉花纤维样品的每克干样中微生物的数量
权利要求
1.ー种用于检测棉花纤维上携帯的微生物的方法，所述方法包括以下步骤 (1)称取一定量的待测棉花纤维样品，计算所述棉花纤维样品的样品含水率； (2)称取与步骤(I)中的所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维，并用无菌水浸泡，摇床培养1-3小时，得到浸泡液母液； (3)取部分所述浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到稀释液； (4)分别将0.1-0. 3ml稀释液接种在不同的选择性培养基上，并在28°C _30°C的温度下进行培养； (5)根据所述稀释液在所述不同的选择性培养基上的生长情況，鉴定所述棉花纤维上携帯的微生物的种类；以及 (6)记录选择性培养基上的菌落数，然后求平板上菌落数的平均值，井根据下式计算所述棉花纤维样品的每克干样中微生物的数量
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(I)中的样品含水率根据下式计算
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)的具体操作为 将与步骤(I)中所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维置于一定量的无菌水中，手动摇晃至待测棉花纤维全部浸湿，置于转速为100-150rpm/min的摇床上培养1_3小时，得到浸泡液母液；待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1-0. 3g 10ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1g : 10ml。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的梯度稀释的倍数由以下预实验步骤确定，所述预实验步骤包括 (i)称取一定量的待测棉花纤维，用无菌水将所述待测棉花纤维浸泡，其中所述待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1-0. 3g 10ml，摇床培养1-3小时，得到浸泡液母液，然后使用无菌水对所述浸泡液母液进行梯度稀释，分别得到不同稀释倍数的稀释液； (ii)将每ー种所述不同稀释倍数的稀释液分别接种于不同的选择性培养基上，并在280C -30°C的温度下进行培养； (iii)计数不同的选择性培养基上的菌落数；以及 (iv)选择腐生好氧性细菌的选择性培养基、腐生厌氧性细菌的选择性培养基、放线菌的选择性培养基、好氧性纤维素分解菌的选择性培养基或厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基上菌落数在20-200之间，真菌的选择性培养基上菌落数在10-100之间的稀释倍数用于本发明所述方法的步骤(3)。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述预实验步骤(i)中所述不同稀释倍数为100倍、1000 倍或 10000 倍。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述预实验步骤(ii)中的培养时间根据不同的选择性培养基而不同，对腐生好氧性细菌和腐生厌氧性细菌的选择性培养基的培养为3-5天；对真菌的选择性培养基的培养为5-7天；对放线菌的选择性培养基的培养为7-10天；对好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基的培养为5-7天。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中对不同的选择性培养基进行培养的时间根据不同的选择性培养基而不同，对腐生好氧性细菌和腐生厌氧性细菌的选择性培养基的培养为3-5天；对真菌的选择性培养基的培养为5-7天；对放线菌的选择性培养基的培养为7-10天；对好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基的培养为5-7天。
9.如权利要求1所述的方法，其中步骤(5)的鉴定方法为根据不同微生物菌落特征进行鉴定。
10.如权利要求1所述的方法，其中步骤(6)的计数方法为平板计数法，即肉眼观察，记录整个平板上的菌落数。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。该方法是将一定重量的棉花纤维浸入一定体积的无菌水中，在合适转速条件下摇床培养一段时间得到浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到相应浓度的稀释液，将该稀释液分别接种在不同的选择性培养基上培养，根据稀释液在选择性培养基上的生长情况，鉴定棉花纤维上携带的微生物的种类，并计算微生物的数量。该方法具有较强的操作性和实用性，简单易行。
文档编号C12Q1/06GK103045714SQ201110309038
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者雒珺瑜, 崔金杰, 马艳, 黄群, 王春义, 张帅, 吕丽敏, 辛惠江, 李春花, 吴冬梅 申请人:中国农业科学院棉花研究所