专利名称：用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌培养技术领域的培养基及其制备方法，具体是一种海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基及其制备方法。
背景技术：
Terrein (土曲霉酮)是一种环戊烯酮类化合物，最初由土曲霉发酵得到，尽管发现距今已有70余年，但它的许多活性却是直到本世纪才被陆续发现的。Terrein的活性十分多样，不仅具有抗细菌、真菌、杂草的活性，还可以抑制肿瘤细胞血管新生素的分泌，抑制黑色素合成，抑制皮肤角质增生，抑制牙髓细胞炎症反应，促进成骨细胞与钛支架融合等。 可以预见Terrein将来在医疗、美容、农业等众多领域会有良好的应用前景，当然前提是 Terrein的制备技术取得突破。然而现有的Terrein制备方法都存在一些不足。首先，一些化学合成制备 Terrein的技术往往有总产率低，需要采用高温高压等极端反应条件，需要昂贵的反应试剂，或是终产物不具备立体结构的选择性等缺点(Lee S, et al. Synthesis and melanin biosynthesis inhibitory activity of (士)_terrein produced by Penicillium sp. 20135. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2005;15:471-473)。其次，采用微生物发酵制备Terrein的技术产量又十分有限，少则数百μ g/L (Phattanawasin P, et al. Weed growth inhibitors from Aspergillus fischeri TISTR 3272. Natural Product Research 2007; 21:1286—1291 )，多则数百 mg/L (Μ. Demasi, et al. Studies on Terrein as a New Class of Proteasome Inhibitors. Journal of the Brazilian Chemical Society 2010; 21: 2四_305)，而未能达到具备生产价值的g/L量级。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺点，提供一种海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基及其制备方法。采用本发明的方法对海绵共生土曲霉产Terrein的培养基成分进行了优化，使得Terrein的产量有明显提高。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
本发明涉及一种用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基，所述培养基包括 葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠、氯化铵以及人工海水。优选的，所述海绵共生土曲霉为土曲霉(Aspergillus terreus ) PF26 CGMCC NO. 5208。优选的，所述培养基具体为当培养基中含有的人工海水为IL时，培养基含有葡萄糖28. 41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵 10.OOgo优选的，所述人工海水具体为，人工海水由以下质量的各组份氯化钠26. 518g、氯化镁2.447g、硫酸镁3. 305g、氯化钙1. 141g、氯化钾0. 725g、碳酸氢钠0. 202g、溴化钠0. 083g，溶解于IL蒸馏水中组成；所述人工海水的pH值为7. 0 7. 2。本发明还涉及一种上述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基的制备方法，包括以下步骤
第一步，配制人工海水；
第二步，在配制好的人工海水中加入葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠和氯化铵并搅拌溶解，然后进行高温杀菌得到培养基。优选的，第二步中，所述培养基具体为，当培养基含有的人工海水为IL时，培养基含有葡萄糖观.41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵 10. OOgo优选的，第一步中，所述配制人工海水具体为，配置人工海水包括如下步骤将 26. 518g氯化钠、2. 447g氯化镁、3. 305g硫酸镁、1. 141g氯化钙、0. 725g氯化钾、0. 202g碳酸氢钠以及0.083g溴化钠溶解于IL蒸馏水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值为 7. 0 7. 2。优选的，第二步中，所述高温杀菌是在115°C环境下灭菌30分钟。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为采用本发明方法成功的对海绵共生土曲霉产Terrein的培养基成分进行了优化。在摇瓶水平上，将菌种分别接种到基本培养基和最优培养基中，比较两种培养基中菌种的生长情况和产Terrein的情况；在最优培养基中发酵24d的Terrein的产量达到3. 71g/L，是在未优化的基本培养基中产量(1. 73g/L) 的2. 1倍；这表明，在摇瓶水平上，Terrein的产量有明显提高。
图1为海绵共生土曲霉发酵Terrein产量在不同基本培养基中的对比图2为海绵共生土曲霉发酵Terrein产量在基本培养基和最优培养基中的对比图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中涉及iTerrein的具体为土曲霉Aspergillus terreus菌株PF26， 分离自中国南海永兴岛Wiakellia fusca海绵，其保藏信息为该菌株已于2011年8月 31日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 5208;保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。实施例1、确定比较好的基本培养基配方四种基本培养基的配制如下
1)基本培养基一 30g蔗糖、2g硝酸钠、IOmL磷酸缓冲液、ImL铁盐溶液溶解于IL人工海水；
所述的磷酸缓冲液的组份及浓度含量为0. 4mol/L的K2HPO4,0. 2mol/L的KH2PO4，溶剂为蒸馏水，该磷酸缓冲液的pH为7. 1。
所述的铁盐溶液的组份及浓度含量为0. 06mol/L的FeSO4,0. 04mol/L柠檬酸三钠，溶剂为蒸馏水。2)基本培养基二 IOg葡萄糖、20g麦芽糖、20g甘露醇、3g麦芽提取物、IOg谷氨酸钠和IOg氯化铵溶解于IL人工海水；
3)基本培养基三40g麦芽糊精，30g麦芽糖，40g蔗糖，2g谷氨酸钠，Ig酵母提取物，Ig 大豆蛋白胨和2g胰蛋白胨溶解于IL人工海水；
4)基本培养基四50g乳糖，20g葡萄糖，IOg甘油，6g大豆蛋白胨和4g酵母提取物溶解于IL人工海水。以上四种培养基皆于115°C灭菌30min，其中，所述人工海水包含以下质量的各组份氯化钠(NaCl) 26. 518g、氯化镁(MgCl2) 2. 447g、硫酸镁(MgSO4 ) 3. 305g、氯化钙 (CaCl2) 1. 141g、氯化钾(KCl) 0. 725g、碳酸氢钠(NaHCO3) 0. 202g、溴化钠(NaBr) 0. 083g 溶解于IL蒸馏水中，所述人工海水的pH值为7. 0 7. 2。 分别以上述四种培养基进行发酵，菌种接种量为4X IO6个孢子/mL，在250mL三角瓶中装液量1001^，在^°C、180rpm的恒温摇床中培养，pH自然。采用HPLC法测定Terrein含量，图1所示为海绵共生土曲霉发酵Terrein产量在以上四种不同基本培养基中的对比图，由图1可知以上四种培养基中Terrein含量分别为0. 49g/L，1. 73g/L, 0. 52g/L和0. 38g/L。由此得到比较好的基本培养基配方(配方1) 为10g葡萄糖、20g麦芽糖、20g甘露醇、3g麦芽提取物、IOg谷氨酸钠、IOg氯化铵，IL人工海水配制，PH自然。以配方1进行发酵，Terrein产量为1. 73g/L。实施例2、应用Plackett-Burman设计和响应曲面法确定最优培养基
在上述实施例1确定的比较好的基本培养基配方1的基础上，首先应用 Plackett-Burman设计挑选出对Terrein产量影响较大的因素葡萄糖、麦芽糖和麦芽提取物。它们的添加量水平如表1所示
表1 Plackett-Burman实验中各因素的高低值
筛选出重要因素后，应用响应曲面法，进一步优化葡萄糖、麦芽糖和麦芽提取物的最优培养浓度。首先通过单因素实验找到中心点浓度，分别为20g葡萄糖、40g麦芽糖和6g麦芽提取物，其次以中心复合设计确定它们的添加量水平如表2所示 表2中心复合设计中重要因素的编码值和实际值浓度
权利要求
1.一种用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基，其特征在于，所述培养基包括葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠、氯化铵以及人工海水。
2.根据权利要求1所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基，其特征在于，所述海绵共生土曲霉为土曲霉(Asper^iVAz1S terreus) PF26 CGMCC NO. 5208。
3.根据权利要求1或2所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基， 其特征在于，所述培养基具体为当培养基中含有的人工海水为IL时，培养基含有葡萄糖28. 41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵 10.OOgo
4.根据权利要求1或2所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基，其特征在于，所述人工海水具体为，人工海水由以下质量的各组份氯化钠^5.518g、氯化镁2.447g、硫酸镁3. 305g、氯化钙1. 141g、氯化钾0. 725g、碳酸氢钠0. 202g、溴化钠 0. 083g，溶解于IL蒸馏水中组成；所述人工海水的pH值为7. 0 7. 2。
5.一种根据权利要求1所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，配制人工海水；第二步，在配制好的人工海水中加入葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠和氯化铵并搅拌溶解，然后进行高温杀菌得到培养基。
6.根据权利要求5所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基的制备方法，其特征在于，第二步中，所述培养基具体为，当培养基含有的人工海水为IL时，培养基含有葡萄糖观.41g、麦芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麦芽提取物8. 52g、谷氨酸钠10. 00g、氯化铵 10. OOgo
7.根据权利要求6所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基的制备方法，其特征在于，第一步中，所述配制人工海水具体为，配置人工海水包括如下步骤将 26. 518g氯化钠、2. 447g氯化镁、3. 305g硫酸镁、1. 141g氯化钙、0. 725g氯化钾、0. 202g 碳酸氢钠以及0. 083g溴化钠溶解于IL蒸馏水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值为 7. 0 7. 2。
8.根据权利要求5、6或7所述的用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基的制备方法，其特征在于，第二步中，所述高温杀菌是在115°C环境下灭菌30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基及其制备方法。所述培养基包括葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠、氯化铵以及人工海水。优选方案为所述培养基具体为当培养基中含有的人工海水为1L时，培养基含有葡萄糖28.41g、麦芽糖23.18g、甘露醇20.00g、麦芽提取物8.52g、谷氨酸钠10.00g、氯化铵10.00g。所述制备方法，包括以下步骤第一步，配制人工海水；第二步，在配制好的人工海水中加入葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽提取物、谷氨酸钠和氯化铵并搅拌溶解，然后进行高温杀菌得到培养基。与现有技术相比，采用本发明方法成功的对海绵共生土曲霉产Terrein的培养基成分进行了优化，使得Terrein产量有明显提高。
文档编号C12R1/66GK102559780SQ201110311460
公开日2012年7月11日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者张凤丽, 李志勇, 殷颖, 高强 申请人:上海交通大学