专利名称:一种用磁性微粒从含微量核酸的样本中纯化dna的方法
技术领域:
本发明涉及一种利用磁性纳微米材料纯化DNA的方法。
背景技术:
核酸提取是许多分子生物学技术中的关键步骤,由于对纯度、完整性等要求,其提取方法尤为重要。而随着法医学、基因组等学科的高速发展,法医DNA检验不仅为法医个体识别鉴定了基础,并也成为刑事技术中唯一能通过对微量生物物证进行检验直接认定罪犯的高新技术手段。因此,选择高性能的DNA纯化方法成为法医DNA建库和案件分析的首要条件。目前国内外对于核酸纯化的报道和试剂盒很多,总结起来大体上可分为两种,一种是酚氯仿抽提液相纯化法,一种是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合,从而达到纯化核酸的目的,其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。目前常用的几种DNA提取方法均存在一些缺点。如酚_氯仿的液相纯化方法, 不仅操作时间长,步骤繁琐,而且在操作过程中常用到有机污染溶剂,造成环境污染。 Chelex-IOO法,因其省时、成本低、操作简单、减少了有机试剂的使用,因此成为法医检测 DNA纯化的常用方法。其原理基于树脂的螯合作用去除痕量金属离子等下游PCR的抑制剂。 但该方法得到的DNA纯度不高,不利于下游分子生物学的应用,并且得到的DNA保存效果较差,当DNA保存时间过长(一年以上),再进行STR扩增,结果有明显的降解,如峰失调,等位基因丢失。目前,从法医样本中或含微量核酸样本中纯化DNA的试剂盒甚少,主要是由国外一些公司生产,如Qiagen公司、Promega公司等,而又以离心柱法为其主流的手动操作方法,其价格昂贵且步骤繁琐,不利于推广使用。利用磁性载体进行核酸纯化是近年来发展起来的一种DNA纯化方法,即利用具有超顺磁性的纳米或微米级球形颗粒作为固相介质来非特异性的吸附核酸,在外加磁场的作用下便将DNA-磁性微粒复合体与蛋白质、多糖等杂质分离开来,可省去离心、过滤等繁杂的操作,减少了过多的机械剪切作用对核酸造成的损伤,而当撤去磁场后,磁性微粒很快均勻分散于溶液中。由于它具有操作简便、纯度高、无酚、氯仿等有机试剂污染的特点,越来越受到人们的亲睐,并且它易于实现自动化,满足了法医样本中大规模建库等高通量操作的需求。专利ZL 200920090335. 6采用纳米级硅包被磁性微球为固相载体,配制不同的裂解液、结合液、清洗液等针对不同的检材来纯化法医样本的DNA,但由于该方法需针对不同的样本,配置不同的裂解、结合、清洗体系来纯化得到基因组DNA,并且在该专利方法包含了预裂解步骤,步骤繁琐、复杂,大大延长实验操作的时间。专利ZL 101935646A公开了一种利用磁珠从微量样品中提取DNA的方法,该方法只阐述了从干血点、唾液、毛发这三种样品中纯化其基因组DNA,未能涉及到更多样本的纯化结果。
发明内容
为了解决背景技术中的上述问题,本发明提供一种利用磁性纳米复合材料简便、 快速、有效地从法医样本等含微量核酸的样本中纯化DNA的方法。本发明的技术方案一种用磁性微粒从含微量核酸的样本中纯化DNA的方法,该方法包括以下步骤(1)裂解样品 取待纯化样品,加入终浓度分别为3 6M的胍盐裂解液和0. 01 0. 05M的二硫苏糖醇,混勻后于水浴中充分裂解5 30min ;(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液取200 600 μ g磁性微粒加入步骤(1)得到的裂解后的溶液中,振荡混勻,于室温充分结合,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离对混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集;⑷清洗清洗收集到的磁性微粒-DNA复合物,去除抑制下游应用的杂质;(5)洗脱将洗脱液与清洗后的磁性微粒-DNA复合物混合均勻,使DNA从磁性微粒上洗脱下来,在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,即为纯化的DNA。上述步骤(1)中胍盐裂解液包括以下成分3 6M GuHCl, 3 6M GuSCN, 0. 005 0. OlM EDTA,0. 005 0. OlM NaCl,终浓度为 4% 6% 的 Triton X-100 和终浓度为 15% 80%的醇。上述步骤(1)中胍盐裂解液中所含的醇优选乙醇或异丙醇。上述步骤(4)可以采用先后加入两种清洗液混勻、磁性分离弃上清;第一种清洗液的主要成分是3 6M GuHCl,终浓度为30% 50%的乙醇;第二种清洗液的主要成分是0. 5M IM乙酸钠,终浓度为50% 75%的乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合物。上述步骤(5)中洗脱液优选IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或无核酶水。上述步骤(1)水浴反应最佳温度为95°C。本发明涉及到的表示浓度的百分比均为体积百分比,比如30% 50%的乙醇,即指无水乙醇占溶液整体的体积分数为30% 50%。本发明的优点1、本发明能够从含有微量核酸的样品中成功提取得到高纯度的DNA。2、本发明在裂解液中加入了适当体积百分含量的醇类物质,不仅可以使核酸特异性地结合到磁性微量上形成磁性微粒-DNA复合物,提高最终所获得的DNA总量,并且简化了类似磁性微粒纯化过程中需对磁性微粒预处理的步骤。3、本专利采用盐酸胍裂解液裂解细胞,不需要分步裂解。从样品中提取到的DNA, 纯度高,不含有抑制下游PCR反应的抑制剂。4、不需要离心机等大型仪器,减少了机械使用中的物理性剪切,亦避免了离心过
4程对基因组DNA的破坏。5、操作步骤简便,时间短,全部过程只需要15 45min左右(根据不同样本,裂解的时间不同),从而大大缩短了提取DNA的时间。本发明可满足从法医样本中提取高质量的DNA,并应用于下游PCR扩增、STR分型等应用;该方法无需离心,操作步骤快速、简便。根据本发明,还可制作出既适用于手动操作又可配套自动化仪器从而纯化得到法医样本DNA的试剂盒。
图1是纯化得到的血斑DNA进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图谱(10 μ IPCR产物进行琼脂糖电泳;M =DL 2000Marker)。图2是纯化得到的血斑DNA的STR分型图谱。图3是纯化得到的口腔拭子DNA的STR分型图谱。图4是纯化得到的烟蒂DNA的STR分型图谱。图5是纯化得到的毛发DNA的STR分型图谱。图6是纯化得到的指甲DNA的STR分型图谱。图7是利用自动化仪器纯化得到的血斑DNA的STR分型图谱。
具体实施例一种用磁性微粒从法医样本中纯化DNA的方法,包括以下步骤(1)裂解样品取一定量的法医样本如微量的血液、血斑、口腔拭子、烟蒂、毛发等样品,经过简单的前期处理,如将烟蒂的滤纸剪碎等操作步骤。加入浓度为3 6M的胍盐裂解液0. OlM 0. 05M的二硫苏糖醇,混勻后于95°C水浴中充分裂解5 30min ;其中,胍盐裂解液的成分是3 6M GuHCl,3 6MGuSCN,0. 005 0. OlM EDTA,0. 005 0. OlM NaCl, 4 6% Triton X-100 (体积百分比)和15 80% (体积百分含量)的醇,醇可以是乙醇或者异丙醇;二硫苏糖醇(DTT)浓度可随样本的不同而适当调整。如毛发和精斑这类含蛋白质含量较高的样本时,可适当增加DTT的浓度。(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液取100 600 μ g磁性微粒加入到裂解后的溶液中,振荡混勻,于室温充分结合,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液。(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离将混合溶液磁性分离,弃去上清, 将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集。(4)清洗分别用清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA复合物,去除蛋白质等抑制下游应用的杂质物质;具体可以先用清洗液I去除蛋白质,清洗次数为1 3次;再用清洗液 II去除残留的小分子杂质物质,清洗次数可为2 4次。其中,清洗液I是含有盐酸胍的醇溶液,其中盐酸胍的浓度为3M 6M,醇是30% 50% (体积百分含量)的乙醇;清洗液 II是含有乙酸钠的醇溶液,其中乙酸钠的终浓度为0. 5M 1M,醇是50% 75% (体积百分含量)的乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合物。(5)洗脱将洗脱液与磁性微粒-DNA复合物混合均勻,使DNA从磁性微粒上洗脱下来,在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,即为纯化的DNA。
洗脱液可以采用IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或无核酶水。以下用实施例对本发明做进一步详细说明,但并不限定本发明的保护范围。实施例1 从血斑中纯化基因组DNA的方法及效果验证1. DNA 的纯化(1)样品裂解利用打孔器将直径为5mm2的血斑打入1. 5ml的离心管中,依次加入150 μ 1胍盐裂解液(胍盐裂解液的浓度为6Μ,成分是3 6Μ GuHCl,3 6Μ GuSCN, 0.005 0. OlM EDTA,0. 005 0. OlM NaCl,4 6% Triton X-100 (体积百分比)及 15-80% (体积百分含量)的醇。)和1. 5μ 1的DTT(IM),涡旋仪震荡混勻,95°C水浴充分裂解30min。(2)将充分裂解后的血斑样本,挑离载体。(3)核酸吸附于固相载体向步骤⑵所得到的裂解液中加入10 μ 1浓度为30mg/ml的磁性微粒,涡旋震荡混合后,静置5min形成磁性微粒-DNA的复合体。(4)清洗从磁性分离器上取出离心管,加入150 μ 1清洗液I (清洗液I是含有盐酸胍的醇溶液,其中盐酸胍的浓度为3Μ 6Μ,醇是30% 80% (体积百分含量)的乙醇), 吹吸混勻,磁性分离直至上清澄清,弃上清;从磁性分离器上取出离心管,加入150 μ 1清洗液II (清洗液II是含有乙酸钠的醇溶液,其中乙酸钠的终浓度为0. 5Μ 1Μ,醇是50% 75% (体积百分含量)的乙醇和异丙醇),吹吸混勻,磁性分离直至上清澄清,弃上清。重复本操作一次。打开离心管盖并将其离心管架上上,室温晾干5min。(5)从磁性分离器上取出离心管,向管中加入50 μ 1无核酶水,吹吸混勻,65°C 水浴5min ;将离心管置于磁性分离器上,磁性分离直至上清澄清,上清液即为纯化得到的 DNA,将上清液转移到另一离心管中,上清即为纯化的DNA,可直接用于下游实验或于-20°C 保存备用。2. PCR 的扩增取10μ 1纯化得到的DNA进行PCR扩增反应。扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳, 结果如图1所示,条带清晰完整。3. STR复合扩增分析将纯化后的DNA进行STR复合扩增(所采用的复合扩增试剂盒为市售的美国ABI 公司的扩增试剂盒),然后用ABI 3100型遗传分析仪检测,结果如图2所示,STR位点完整, 分型准确,无等位基因丢失、不平衡扩增等现象出现,表明该纯化方法纯化效率高,得到的 DNA纯度高,完整性好。实施例2 从口腔拭子中纯化基因组DNA的方法及效果验证口腔拭子的准备,清水漱口三遍,用口拭子棉签在口腔两侧轻轻地擦拭,阴干,备用。1. DNA 的纯化纯化时剪取含有口腔粘膜细胞的口腔棉签外围薄博的一层作为实验检材。其后步骤与实施例1相同。2. STR复合扩增分析将纯化后得到的DNA进行STR复合扩增分析,与实施例1的STR复合扩增分析方法相同,结果如图3所示,STR位点完整,分型准确,无等位基因丢失、不平衡扩增等现象出现,表明该纯化方法纯化效率高,得到的DNA纯度高,完整性好。实施例3 从烟蒂中纯化基因组DNA的方法及效果验证1.样品的准备一般来说,对于有明显咬痕的烟蒂我们通常剪取位于咬痕部位以上的部分,对于没有明显咬痕的烟蒂,则尽量剪取烟蒂的上端,一般剪取大小约为2cmX2cm的一块,在裂解前尽量将其剪碎。2. DNA 的纯化步骤与实施例1相同。3. STR复合扩增分析将纯化后得到的DNA进行STR复合扩增分析,与实施例1的STR复合扩增分析方法相同,结果如图4所示,STR位点完整,分型准确,无等位基因丢失、不平衡扩增等现象出现,表明该纯化方法纯化效率高,得到的DNA纯度高,完整性好。实施例4 从毛发和指甲中纯化基因组DNA的方法及效果验证1. DNA 的纯化对于头发和指甲这种比较坚硬的组织,在纯化前要先进过消化,消化的具体方法是将指甲(尽量剪碎)和头发(含毛囊)分别加入到1. 5ml的离心管中,之后加入20 μ 1 蛋白酶K和TES的条件下,56°C消化过夜。消化后涡旋振荡,l,2000rpm离心2min,留上清。其后步骤与实施例1相同。2. STR复合扩增分析将纯化后得到的DNA进行STR复合扩增分析,其方法与实施例1的方法相同,结果如图5所示,STR位点完整,分型准确,无等位基因丢失、不平衡扩增等现象出现,表明该纯化方法纯化效率高,得到的DNA纯度高,完整性好。实施例5 利用自动化纯化基因组DNA的方法及效果验证1. DNA 的纯化以血斑作为实验检材,配套自动化仪器进行实验。首先将所需要的溶液按血斑样本、裂解液、磁性微粒、清洗液I、清洗液II、清洗液 II、洗脱液的顺序依次加入到96深孔板1-6孔中。然后运行自动化仪器进行试验,运行程序参照实施例1进行DNA的纯化。2. STR复合扩增分析将纯化后得到的DNA进行STR复合扩增分析,其方法与实施例1的方法相同,结果如图6所示,STR位点完整,分型准确,无等位基因丢失、不平衡扩增等现象出现,表明该纯化方法纯化效率高,得到的DNA纯度高,完整性好。
权利要求
1.一种用磁性微粒从含微量核酸的样本中纯化DNA的方法,其特征在于该方法包括以下步骤(1)裂解样品取待纯化样品,加入终浓度分别为3 6M的胍盐裂解液和0. 01 0. 05M的二硫苏糖醇,混勻后于水浴中充分裂解5 30min ;(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液取200 600 μ g磁性微粒加入步骤(1)得到的裂解后的溶液中,振荡混勻,于室温充分结合,形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离对混合溶液磁性分离,弃去上清,将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离出来,收集;(4)清洗清洗收集到的磁性微粒-DNA复合物,去除抑制下游应用的杂质;(5)洗脱将洗脱液与清洗后的磁性微粒-DNA复合物混合均勻,使DNA从磁性微粒上洗脱下来, 在外加磁场作用下将磁性微粒和洗脱下来的DNA分离,收集上清,即为纯化的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)中胍盐裂解液包括以下成分 3 6M GuHCl,3 6M GuSCN,0. 005 0. OlM EDTA,0. 005 0. OlMNaCl,终浓度为 4% 6%的Triton X-100和终浓度为15% 80%的醇。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤(1)中胍盐裂解液中所含的醇为乙醇或异丙醇。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(4)是先后加入两种清洗液混勻、磁性分离弃上清;第一种清洗液的主要成分是3 6M GuHCl,终浓度为30% 50%的乙醇; 第二种清洗液的主要成分是0. 5M IM乙酸钠,终浓度为50% 75%的乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(5)中洗脱液是IOmMTris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或无核酶水。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)水浴反应温度为95°C。
全文摘要
本发明提供一种利用磁性纳米复合材料简便、快速、有效地从法医样本等含微量核酸的样本中纯化DNA的方法。该方法包括以下步骤(1)取待纯化样品,加入终浓度分别为3~6M的胍盐裂解液和0.01~0.05M的二硫苏糖醇,混匀后于水浴中充分裂解5~30min;(2)形成含磁性微粒-DNA复合物的混合溶液;(3)将磁性微粒-DNA复合物从混合溶液中分离;(4)清洗;(5)洗脱获得纯化的DNA。本发明可满足从法医样本中提取高质量的DNA,并应用于下游PCR扩增、STR分型等应用;该方法无需离心,操作步骤快速、简便。根据本发明,还可制作出既适用于手动操作又可配套自动化仪器从而纯化得到法医样本DNA的试剂盒。
文档编号C12N15/10GK102352351SQ201110314908
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者崔亚丽, 张景阁, 李芳 , 杨柳, 赵稳操, 邓晨 申请人:西安金磁纳米生物技术有限公司