专利名称：一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别是一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌及其发酵丁醇中的应用。
背景技术：
在化工生产中，丁醇是一种重要的精细化工原料，用途非常广泛。既可用作溶剂， 生产邻苯二甲酸二丁酯等增塑剂及丁醛、磷酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯等化学品，也被作为油脂、药物和香料的萃取剂。在可替代石油的液体燃料上，丁醇由于具有高能量密度、低亲水性、高辛烷值以及不易挥发等远远优异于乙醇的特点，因而被认为是适宜替代石油的新一代液体燃料能源。石油能源危机引起了各国对未来能源供应不足的普遍关注，并促使人类寻求可再生的生物基材料来代替石油。因而，利用生物发酵的方法来生产丁醇获得了人们的青睐。在丁醇发酵生产过程中原料成本占了约60-70 %，是生物发酵丁醇推广应用的瓶颈。生物发酵丁醇的传统原料是玉米。玉米是粮食类作物，价格高，而且市场供应波动大。开发非粮、廉价的生物质原料是丁醇生物发酵生产的迫切要求。木薯单位面积的生物产量高于绝大多数栽培作物，是中国华南地区栽种的主要作物之一。木薯已是南方地区酒精发酵的主要原料。但目前的丁醇发酵工业中使用的丁醇发酵菌株对于木薯原料的利用能力很弱。工业界和各个研究小组对于新型丁醇发酵菌株的研究一直没有中断。但现有的研究在对木薯的利用上面进展不大。如中国专利申请CN95111733.5公开了一种高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培养方法与应用，其中涉及的产高丁醇梭菌利用玉米作为发酵原料，可以获得丁醇的高比例生产。但是这个菌株在木薯为原料的培养基中发酵能力很弱，丁醇产量不高。而中国专利申请CN101353632A公开了一株丙酮丁醇梭菌及其筛选方法和用途，涉及到一个高丁醇产量的突变菌株的筛选，这个突变体对马铃薯淀粉具有高的利用能力。这些研究没有涉及到利用木薯高产丁醇的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌，其突出的优势在于以木薯作为原料具有高丁醇的生产能力。这个菌株具有很好的发酵优化和遗传改造前景，同时也具有重要的工业应用价值。本发明通过以下技术方案达到上述目的提供一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCCM 2011观0，保藏日期2011年8月9日，地址中国武汉市武昌珞珈山武汉大学内。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米为原料发酵丁醇中的应用，所述发酵培养基为含玉米淀粉的培养液。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯为原料发酵丁醇中的应用，所述发酵培养基为含木薯淀粉的培养液，所述含木薯淀粉的培养液中的木薯淀粉质量百分含量为10%，0. 6g/L硫酸镁、0. 5g/L的硫酸二氢钾以及3g/L的醋酸铵。发酵的温度为37°C。 本发明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1特性在于具有发酵生产丁醇的能力。特别是在以木薯淀粉作为原料的发酵液中具有发酵丁醇达到 13. 02g/L的能力。
具体实施例方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。1、丙酮丁醇梭菌的分离纯化采集自南宁郊区的植物根系土样10份。将土样装入有IOmL的TYA培养基试管中， 培养基组成葡萄糖40克，牛肉膏2克，酵母膏2克，胰蛋白胨6克，醋酸铵3克，磷酸二氢钾0. 5克，七水硫酸镁0. 2克和七水硫酸铁0. 01克，混合后，在沸水中加热1分钟，在厌氧培养箱中于37°C温度下培养。定期观察，挑出有气泡产生的试管，在TYA培养基中加入1.5% 琼脂，在平板中分离单菌落。单菌落转移到含有质量百分比为8%玉米粉培养基进行培养， 挑选出生长和产气快速的菌株再转移到8%木薯淀粉培养基中培养。从木薯培养基中挑选出一株生长速度快、丁醇产量高的菌株gxaslS-l。对菌株gxasl8-l的16s rDNA的序列分析表明，菌株gxasl8_l与Clostridium acetobutylicumATCC 824 的 16s ribosomal RNA 基因的相似性为 100%，因而 gxas 18-1 菌株为丙酮丁醇梭菌。2、以玉米为原料发酵产丁醇将菌株gxas 18-1用TYA培养基静置培养M小时，作为发酵种子液。将发酵种子液按照体积百分比5%接种到装有0. 5L质量百分含量为10%的玉米粉的培养基的1. 3L发酵罐中进行厌氧发酵，通入氮气来祛除氧。发酵温度为37°C，在IOOrpm转速培养，发酵时间为48小时。发酵液用气相色谱测定丁醇含量。测定结果丁醇为11^6g/L，ABE总溶剂为 17.92g/L03、以木薯为原料发酵产丁醇将菌株gxas 18-1用TYA培养基静置培养M小时，作为发酵种子液。将发酵种子液按照体积百分比5%接种到装有0. 5L质量百分含量为10%的木薯粉的发酵培养基中，添加有0. 6g/L硫酸镁、0. 5g/L的硫酸二氢钾以及3g/L的醋酸铵的1. 3L发酵罐中进行厌氧发酵，通入氮气来祛除氧。发酵温度为37°C在IOOrpm转速培养，发酵时间为48小时。发酵液用气相色谱测定丁醇含量。测定结果丁醇为13. 07g/L, ABE总溶剂为21. 53g/L。在以木薯淀粉为原料的发酵液中，菌株gxas 18-1的丁醇发酵量不但大于玉米原料的发酵量，而且超过了野生型菌株耐受13g/L的丁醇极限。4、丁醇的测定方法气相色谱检测条件为样品前处理12000转/分离心1分钟，取上清液200微升， 加入等体积(质量分数)的正丙醇作为内标;Agilent 6800气相色谱仪，色谱条件柱温220°C，载气N2，流速0. 7毫升/分钟，压力7万帕斯卡，进样量0. 2微升，检测器氢火焰检测器。
丁醇标准品购自国药集团化学试剂有限公司，在如上色谱条件下标准品的保留时间为3. 30分钟。
权利要求
1.一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，其特征在于，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC M 2011280o
2.权利要求1所述的利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在发酵生产丁醇中的应用。
3.权利要求1所述的利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米为原料发酵丁醇中的应用，其特征在于发酵培养基为含玉米淀粉的培养液。
4.权利要求1所述的利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯为原料发酵丁醇中的应用，其特征在于发酵培养基为含木薯淀粉的培养液，所述含木薯淀粉的培养液中的木薯淀粉质量百分含量为10%， 0. 6g/L硫酸镁、0. 5g/L的硫酸二氢钾以及3g/L的醋酸铵，发酵的温度为37°C。
全文摘要
本发明公开了一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌及其应用。该丙酮丁醇梭菌保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC M 2011280。这个菌株具有发酵生产丁醇的能力，特别是在以木薯为原料的发酵培养基中丁醇的发酵量可以达到13.07g/L。
文档编号C12N1/20GK102417888SQ20111031536
公开日2012年4月18日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者刘春宇, 左文朴, 庞浩, 裴建新, 黄志民, 黄日波 申请人:广西科学院