专利名称：小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及细胞的分离纯化领域，主要是一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法。
背景技术：
早在1973年美国学者Weinman就发现了具有强大抗原递呈功能的树突状细胞 (Dendritic cells，DC)。这类细胞是目前所知机体内功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。它们通常少量分布于外界接触的皮肤部位，主要为皮肤和鼻腔、肺、胃与肠的内层。而肠道作为人体最大的免疫器官。一方面肠道对各类致病微生物产生免疫应答，消除病原体；另一方面对肠道正常定植的共生菌和日常大量食物蛋白产生免疫耐受，在这一过程中，作为体内功能最强的抗原递呈细胞，树突状细胞起到了关键的作用。肠道内各类抗原主要经过DC传递后，作用于T、B淋巴细胞，其产生的效应取决于DC的类型、接受到的信号分子以及局部微环境的影响。介于树突状细胞在肠道免疫的重要地位，如何分离提取高纯度的DC成为首要任务。根据DC所在肠道位置的不同，主要可以分为在Peyer’ s淋巴结(Peyer’ s patch) DC，肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)DC以及在肠道上皮黏膜固有层(lamia propria, LP)DC。目前在提取Pp DC和MLN DC方面已经比较成熟，且文献报道较多。但在提取LPDC时，由于肠壁构成复杂，结构特殊，肠绒毛的固有层又含有致密结缔组织。所以导致了 LPDC提取的诸多困难。如何有效得提取肠道上皮黏膜固有层树突状细胞成了亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的正是要克服上述技术的不足，而提供一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法。本发明解决其技术问题采用的技术方案本发明公开了小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，具体步骤①获取混合细胞取出生4-6周的C57BL/6小鼠过度麻醉后，用外科手术剪剪开小鼠，取出小肠(十二指肠、空肠、回肠)；将小肠置于37°预热的HBSS BuffeH分离上皮细胞的缓冲液)中，去除脂肪、结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；肠尽可能剪碎， 转移至50毫升离心管中加入30毫升37°C预热的HBSS Buffer，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升 37°C预热的HBSS Buffer，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤， 弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37°C预热的RPMI清洗缓冲液，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37°C预热的RPMI清洗缓冲液，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37°C预热的 collagenase/DNase Solution (胶原酶/DNA酶混合液)，37°C水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤，滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟。上述液体的配置如下a、HBSS称取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去离子水，然后用0. 22 μ m滤膜过滤b、HBSS Buffer (分离上皮细胞的缓冲液)
HBSS47ml
FBS (5%)2.5ml
EDTA (0.05mM)5μ 1
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青霉素、链霉素(IOOx)500 μ 1
DTT (15ug/ml)5μ1c、RPMI清洗缓冲液
HBSS44.5ml
FBS (5%)5ml
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青霉素、链霉素(IOOx)500 μ 1d、collagenase/DNase Solution (胶原酶/DNA 酶混合液)RPMI Buffer9.75mlcollagenase (1. 75mg/ml) 5. 25mlDNase I0. 0075g②单个核细胞的获取胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1 1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升 MACS buffer (美天旎分选缓冲液)，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞。所述 MACS buffer是含有2mM (摩尔/毫升)的EDTA和0. 5 %的FCS (胎牛血清)的PBS (盐离子缓冲液)。③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取=Ficoll密度梯度离心得到的细胞用 MACSbuffer重选，按照美天旎磁珠分选⑶Ilc的说明分选树突状细胞。本发明有益的效果是1、在 HBSS Buffer 中分别加入 DTT (DL-Dithiothreitol, 二硫苏糖醇)和 EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)处理肠道组织，前者有效得去除了上皮细胞，后者使得肠道组织变得疏散，为后续胶原酶消化提供很好的环境。
2、实验过程简单、可操作性强、重复性好。3、分离纯化时间缩短为3-4个小时。区别与传统获得树突状细胞需要的7天时间。4、台盼蓝活细胞计数结果显示，采用本方法，每只老鼠约可获得6-10E5，细胞活性 > 90%。5、在肠道上皮黏膜固有层分选出的树突状细胞不仅仅表达⑶11c，还表达⑶lib。 并且在流式细胞仪上可以清晰的看到四群不同的细胞，即⑶iichiraiibl°、⑶iichiraiibhi、 ⑶1 IcntOTlIbint、⑶Ilcint⑶Ilbhi。这与现有文献提出的理论极其相似。6、避免了传统分离纯化细胞中的机械损伤，对细胞损伤小，最大限度的维持了细胞原有的形态特征。7、区别于传统研究树突状细胞，大多数利用不同剂量的粒细胞-巨噬细胞刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)联合或者不联合重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导培养树突状细胞。但发明直接取得体内的树突状细胞，为直接研究体内免疫机制提供了可能。综上所述，本发明方法可以方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的肠道上皮黏膜固有层树突状细胞，所得细胞在体外条件下保持了良好的抗原递呈能力，为体外模拟体内抗原递呈细胞诱导淋巴细胞分化提供了良好条件。
图1 ⑶Ilc磁珠分选后流式图；图2 ADllchiCDllb1t5 细胞群示意图；图中 PE CDllb, APC CDllc subset 11. 3%H 出的细胞为⑶Ilc1^Dllblt5细胞群，占所有细胞的11.3% ；图3 =CDllchiCDllbl"细胞示意图；图 4 =CDllchiCDllbhi 细胞群示意图，图中 PE CDllb, APC CDllc subset 22. 2%圈出的细胞为⑶llChiroilbhi细胞群，占所有细胞的22. 2% ；图5 =CDllchiCDllbhi 细胞示意图；图 6 :CDllcintCDllbhi 细胞群示意图，图中 PE CDllb,APC CDllc subset 9.02%圈出的细胞为⑶Ilcint⑶Ilbhi细胞群，占所有细胞的9. 02% ；图7 :CD1 ICintCDlIbhi 细胞示意图；图8 =CDllCintCDllbint 细胞群示意图；图中 PE CDlIb，APC CDllc subset 19. 2% 圈出的细胞为⑶Iicint⑶Ilbint细胞群，占所有细胞的19.2% ；图9 :CD1 ICintCDlIbint 细胞示意图。所有图横坐标表示PE标记的⑶lib的荧光信号强弱，纵坐标为APC标记的⑶Ilc 的荧光信号强弱。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明公开了小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，是将小鼠的小肠在去除肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)、Peyer，s淋巴结(Peyer，s patch)的情况下，剪成碎末用胶原酶消化成单个细胞。利用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。最后用CDllc磁珠分选肠道上皮黏膜固有层树突状细胞。本发明可以方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的肠道上皮黏膜固有层树突状细胞。具体步骤如下①获取混合细胞取出生4-6周的C57/B6小鼠过度麻醉后，用外科手术剪剪开小鼠，取出小肠(十二指肠、空肠、回肠)；将小肠置于37°预热的HBSS Buffer中，去除脂肪、 结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；肠尽可能剪碎，转移至50毫升离心管中加入30毫升37°C预热的HBSS Buffer，37°C水浴15毫升，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤， 弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37°C预热的HBSS Buffer, 37°C水浴15 分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50ml离心管中加入25ml 37°C预热的RPMI Buffer，37°C水浴15min，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50ml离心管中加入25ml 37°C预热的RPMI清洗缓冲液，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37°C预热的collagenase/DNase Solution，37°C水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤， 滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟。上述液体的配置如下a、HBSS称取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去离子水，然后用0. 22 μ m滤膜过滤b、HBSS Buffer (分离上皮细胞的缓冲液)
HBSS47ml
FBS (5%)2.5ml
EDTA (0.05mM)5μ 1
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青霉素、链霉素(IOOx)500 μ 1
DTT (15ug/ml)5μ1c、RPMI清洗缓冲液
HBSS44.5ml
FBS (5%)5ml
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青霉素、链霉素(IOOx)500 μ 1d、collagenase/DN ase SolutionRPMI Buffer9.75mlcollagenased. 75mg/ml) 5. 25ml
DNase I0. 0075g②单个核细胞的获取胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1 1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACS bufferl200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞。所述MACS buffer是含有2mM的 EDTA 和 0. 5 % 的 FCS 的 PBS。③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取=Ficoll密度梯度离心得到的细胞用 MACSbuffer重选，按照美天旎磁珠分选⑶Ilc的说明分选树突状细胞。可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，其特征在于具体步骤①获取混合细胞取出生4-6周的C57BL/6小鼠过度麻醉后，剪开小鼠，取出小肠；将小肠置于37°预热的分离上皮细胞的缓冲液HBSS Buffer中，去除脂肪、结缔组织、淋巴结，并清洗内容物至干净；小肠剪碎后转移至50毫升离心管中加入30毫升37°C预热的 HBSSBufTer，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37°C预热的HBSS Buffer，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升 37°C预热的RPMI清洗缓冲液，37°C水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入25毫升37°C预热的RPMI清洗缓冲液，37°C 水浴15分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，弃上清，组织块转移至50毫升离心管中加入15毫升37°C预热的collagenase/DNase Solution胶原酶/DNA酶混合液，37°C 水浴60分钟，每5分钟剧烈混摇一次；200目细胞筛过滤，用RPMI清洗缓冲液清洗筛网，再用400目细胞筛过滤，滤液转移至50毫升离心管中，1200转/分钟离心5分钟；②单个核细胞的获取胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1 1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACS buffer美天旎分选缓冲液，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞；所述MACS buffer是含有2mM摩尔/毫升的EDTA和0. 5%的FCS胎牛血清的PBS盐离子缓冲液；③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取=Ficoll密度梯度离心得到的细胞用 MACSbuffer重选，按照美天旎磁珠分选⑶Ilc的说明分选树突状细胞。
2.根据权利要求1所述的小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，其特征在于上述液体的配置如下a、HBSS称取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去离子水，然后用0. 22 μ m滤膜过滤；b、HBSSBuffer分离上皮细胞的缓冲液HBSS47mlFBS 5%2.5mlEDTA 0.05mM5 μ 1HEPES 0.6mM30 μ 1青霉素、链霉素IOOx500 μ 1DTT 15ug/ml5μ 1c、RPMI清洗缓冲液HBSS44.5mlFBS 5%5 mlHEPES 0.6mM30 μ 1青霉素、链霉素 IOOx500 μ 1d、collagenase/DNaseSolution 胶原酶 /DNA 酶混合液RPMI Buffer9.75mlCollagenase 1. 75mg/ml5.25mlDNase I0.0075go
全文摘要
本发明涉及一种小鼠肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的分离纯化方法，具体步骤①获取混合细胞。②单个核细胞的获取胶原酶消化后得到的细胞制成悬液，按1∶1的体积缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中，1800转/分钟离心25分钟；吸取中间白膜层，加入1-2毫升MACSbuffer美天旎分选缓冲液，1200转/分钟离心5分钟；去除上清，重悬细胞。所述MACS buffer是含有2mM摩尔/毫升的EDTA和0.5％的FCS胎牛血清的PBS盐离子缓冲液。③肠道上皮黏膜固有层树突状细胞的获取。本发明有益的效果是方便、短时、经济、高效地获得大量纯度高、活性好的肠道上皮黏膜固有层树突状细胞，所得细胞在体外条件下保持了良好的抗原递呈能力，为体外模拟体内抗原递呈细胞诱导淋巴细胞分化提供了良好条件。
文档编号C12N5/0784GK102382802SQ201110318698
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者张匀, 梁廷波, 白雪莉, 陈伟, 陈灵晓 申请人:梁廷波