专利名称：用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型及其建立方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是涉及一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，以及将该该模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法。
背景技术：
血管新生(angiogenesis)，指成人在原始血管丛或已存在血管的基础上以出芽的方式形成新生血管的过程，具有维持人体正常的生长和平衡的功能，在许多疾病的发生、发展及转归、预后中扮演着重要的角色。近年来，调节血管新生的研究已成为临床治疗中的热点。血管新生主要涉及基底膜的降解、内皮细胞迁移、增殖和管形成等过程，其中内皮细胞的增殖是血管新生的最主要指标之一。同时，内皮细胞功能障碍和死亡还是冠心病、中风、 动脉粥样硬化等多种心血管疾病的重要病理过程。然而由于心血管疾病引起的死亡在疾病死亡率排行版中长居前三甲，因此，临床上一直且迫切的希望发现一种能够有效调节血管新生，保护内皮细胞功能的药物。
关于血管新生方面的研究，目前已有多种体内体外的模型。比如，体外的模型有， 内皮细胞的增殖、迁移、分化模型；相对于体外模型，体内的模型有着更多的生理系统，从而可以从整体上展开对血管新生深入的全面的研究，比如鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型，斑马鱼及转基因斑马鱼模型，小鼠的角膜血管新生模型，肿瘤细胞诱导的小鼠背气囊模型等等，在上述诸多模型中，都能有效的筛选出血管新生潜在的药物，但是随着血管新生研究的越来越深入，以斑马鱼为模型用来研究及筛选血管新生类的药物逐渐被人们所认可。而斑马鱼在血管新生研究中的诸多优势为该类研究提供了便利，比如高产蛋率从而提供了充足大量的实验材料，斑马鱼的基因以及血管新生的调节机理与哺乳动物大量的相同使得该模型的研究更有意义，透明的胚胎与转基因技术(Tg(fli_l =EGFP))相结合使得神秘的血管循环系统成为可见等等。
然而，目前将斑马鱼用来研究血管新生及血管新生药物的筛选都是基于正常的斑马鱼。比如，抗血管新生药物的筛选根据其对斑马鱼胚胎时期背部节间血管(ISV)的影响来判断的，而促血管新生的药物的筛选主要是根据其对斑马鱼胚胎时期肠下静脉血管 (SIV)的影响来判断的。该方法的优势是根据血管新生的血管的特殊形态能够直接快速的发现潜在的血管新生的药物，但是美中不足的是以此方法筛选出的药物对于血管新生类疾病的治疗是不能确定的，换句话说，在正常模型中有效的药物不一定在病理模型中有效，因此，病理模型的药物筛选对于药物治疗效果的要求更为直接也更有意义。然而感到遗憾的是，在斑马鱼这个优秀的研究血管新生的模型中尚未建立一个效果显著，稳定及被认可的血管的病理模型。发明内容
本发明的目的是克服现有的技术的不足，提供一种斑马鱼血管损伤模型，其为病理模型，能够模拟体内血管新生不足的环境进行快速筛选具有促血管新生类的药物。
本发明的另一个目的是提供上述斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其操作简单， 造模成功率高。
本发明还有一个目的是将上述斑马鱼血管损伤模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法，其操作方便、实验结果稳定准确、所需受试药物少、成本低。
为实现以上的目的，本发明采取的技术方案为一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于包括以下顺序步骤
(1)取受精后M-观小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后；
(2)加入浓度为100 600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3_4小时；
(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。
上述方法制得的用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型。
一种筛选抗血管损伤药物的方法，其特征在于包括以下顺序步骤(1)采用上述的斑马鱼血管损伤模型作为空白对照组及受试药物组，取正常生长的且生长时间相同的斑马鱼胚胎为正常对照组，每组斑马鱼数量相等为5-15条；将所配好浓度的受试药物加入到受试药物组的水溶液(胚胎培养基)中，正常对照组和空白对照组则加入等量的溶媒的胚胎培养基；( 给药M，48，72小时分别用荧光显微镜观察血管的形态，并且在给药M小时检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-lA，Flkl-B，Fltl)基因表达的水平的变化。
本发明针对本领域无类似技术而提供了斑马鱼血管损伤模型及其建立方法，以及将斑马鱼血管损伤模型应用于筛选抗血管损伤药物的方法中，克服了现有的技术的不足， 操作方便、造模成功率高、可以模拟体内环境快速筛选、实验结果稳定准确、所需受试药物少、成本低，应用范围广泛，工作效率高。
图1是VRI作用于转基因斑马鱼Tg(fli_l =EGFP)并对其血管影响的时间过程， 其中；A为受精后28小时大的斑马鱼；B，C，D为没有加VRI预处理的分别为受精后31小时大，2，3天大斑马鱼；E，F，G为由VRI预处理的分别为受精后31小时大，2，3天大斑马鱼。
图2是不同浓度的VRI作用于转基因斑马鱼Tg(fli_l =EGFP)并对其血管造成的影响，其中=A为空白对照组(48hpf) ；B，C，D为分别为150，300，600nM/L VRI预处理的3. 5 小时斑马鱼胚胎G^ipf)，E为VRI损伤血管的统计结果，资料士SEM来自三次不同的实验。
图3是VRI诱导斑马鱼血管内皮细胞的凋亡，其中A，D，G为未处理的空白对照； B，E，H为预处理300nM/L VRI的斑马鱼；C，F，I为预处理600nM/L VRI的斑马鱼，J为对 VRI诱导斑马鱼内皮细胞凋亡的统计结果，资料士SEM来自三次不同的实验；与对照组比较 **P < 0. 01。
图4是毛蕊异黄酮能治疗VRI所造成的斑马鱼血管的损伤 小时大的斑马鱼预处理300nM/L VRI后放在不同浓度的毛蕊异黄酮中培养，并在2，3，4天大时进行观察(I， II，III)，其中A为对照组，于含有0. DMSO的胚胎培养基中培养，B为VRI预处理后放在 0. 1 % DMSO培养的组，C，D，E为VRI预处理后分别放在12. 5，25，50 μ M/L毛蕊异黄酮中培养的组。
图5是毛蕊异黄酮能逆转VRI诱导降低的VEGFR基因的表达；资料士SEM来自三次不同的实验；与对照组比较*Ρ < 0. 05，#P < 0. 01 ；毛蕊异黄酮处理的组与模型组(VRI) 比较 P < 0. 01。
具体实施方式
本发明是一种用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型，其建立方法，包括以下顺序步骤(1)取受精后M-观小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后； (2)加入浓度为100 600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3_4小时；(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。
作为优选方案，转基因斑马鱼选用Tg(fli_l :EGFP)。Tg(fli_l =EGFP)为绿色荧光蛋白的表达基因插入到内皮细胞特异性表达的fli-Ι基因内从而使得所有表达fli-Ι基因的地方都有绿色荧光蛋白的表达，最后造成血管的特异性荧光，其非常有利于对血管的变化进行观察。野生型为AB品系，与转基因斑马鱼Tg(fli-1 =EGFP) 一样从斑马鱼国际资源中心(Oregon, P0)购买所得。
造模前对斑马鱼胚胎进行拆蛋壳，目的是加强斑马鱼胚胎对药物的吸收。
作为优选方案，用血管生长因子受体抑制剂造模时，通过筛选多种血管生长因子受体抑制剂，以血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR Kinase Inhibitor II/VRI, Calbiochem Company/EMD Chemicals Inc,cat. no. 676481)效果最佳。因为其它抑制剂如 SU5416, SUl 1652等虽可实现损伤血管，但效果不够理想，而血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR Kinase Inhibitor II)对斑马鱼胚胎的血管能够产生最显著的损伤。
作为优选方案，用血管生长因子受体抑制剂造模时，血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)浓度为300-600nM/L。因为VRI浓度过高如浓度达到或高于600nM/L时对斑马鱼胚胎有一定的心脏毒性，从而整体上影响到斑马鱼胚胎的发育，这对后面的给药处理的恢复效果造成严重的影响；但是要是VRI浓度低于300nM/L，则不能显著的造成斑马鱼胚胎的血管损伤，同样不能得到较佳的筛选抗血管损伤药物模型。由此通过筛选了多个浓度后确定了造模所用的VRI最佳浓度为300nM/L。
用VRI造模时，所需的造模时间为3-4小时。如果过长则会造成损伤的血管难以恢复，对后面的加药处理的结果有很大的影响。如果小于3小时，那么很难造成斑马鱼胚胎血管的损伤，而不能得到筛选抗血管损伤药物模型。本发明对不同的造模时间进行筛选，最终确定所需的最优的造模时间为3小时。
本方案为了加强对斑马鱼胚胎的保护，我们在胚胎的培养以及加药过程中都是使用的斑马鱼的胚胎培养液，其详细配方请参考W^esterfield, Μ. (2000). The zebrafish book.
造模时所用的血管生长因子受体抑制剂造模极性较小，不能很好的溶解在水溶液里，有可能影响造模的成功。作为优选方案，在VRI中加入适量的二甲基亚砜(DMSO)作为助溶剂，并控制二甲基亚砜在溶液中的终浓度不大于)，对斑马鱼的正常活动无影响，而正常对照组中相应的加入了等量的DMS0，以保证实验的科学性。
优选的方案是用纯净去离子水清洗掉抑制剂，最少清洗2遍。
一种筛选抗血管损伤药物的方法，包括以下顺序步骤(1)采用上述的斑马鱼血管损伤模型作为空白对照组及受试药物组，取正常生长的且生长时间相同的斑马鱼胚胎为正常对照组(在空白对照组及受试药物组加入VRI造模时，正常对照组不添加VRI，加入等量的二甲基亚砜替代)，每组斑马鱼数量相等为5-15条；将所配好浓度的受试药物加入到受试药物组的水溶液(胚胎培养基)中，正常对照组和空白对照组则加入等量的二甲基亚砜的胚胎培养基；(2)给药M，48，72小时分别用荧光显微镜观察血管的形态，并且在给药 M小时检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-lA，Flkl-B，Fltl)基因表达的水平的变化。
作为优选方案，采用实时定量链式反应(Quantitative real-time PCR)检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-lA，Flkl-B，Fltl)基因表达。这类基因是血管内皮细胞的特异性表达的基因，这些基因表达的变化可作为判断血管损伤及修复程度的一个指标。
作为优选方案，所受药物为化学药品，中药提取物，中药中的单体化合物，中药复方或它们的组合物均可。
以上上述用斑马鱼血管损伤模型进行筛选抗血管损伤药物的方法，与小鼠、大鼠、 犬、猴等哺乳动物模式生物不同，斑马鱼体积小，对给药要求的量也非常的少，但对于口服或注射都不方便，因此可直接将诱导及测试药物溶解在斑马鱼生活的水中，斑马鱼会自主的连续的从水中吸收药物从而达到实验的目的。
根据下述实施例，可以更好的理解本发明，然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比，实验条件及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明所述的血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)和毛蕊异黄酮的制备可参考常规的药物配置方法，在知道了所需药物的给药剂量以后，药物的配置是本技术领域人员所熟知的。药物剂型为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
以下通过实验及说明书附图进一步描述本发明建立血管的病理模型的可行性。所有资料用mean士SEM表示，统计学比较采用单因素方差分析并用Tukey's test进行组间比较。
实施例1斑马鱼胚胎血管损伤建模及促血管新生药物的快速筛选实验
实验动物以斑马鱼(Danio rerio)受精后1天大的胚胎(Idpf)为材料。野生型及转基因型的斑马鱼由斑马鱼国际资源中心提供(Oregon，P0)，其中野生型为AB品系， 而转基因型的为Tg(fli-1 :EGFP)，转基因斑马鱼是在fli-Ι基因中插入了绿色荧光蛋白基因，故而在转基因型的血管内皮细胞中表达fii-i基因同时也会表达绿色荧光蛋白，因此 Tg(fli-1 =EGFP)将在整个内皮细胞中表达绿色荧光蛋白，喂养方案按照kbrafish Book 描述进行。受精卵由清晨雌雄鱼交配获得，然后将受精卵放于胚胎培养液中，28°C孵化。每天更换孵化液及清理掉坏死的卵。纯净去离子水采用MilliQ水。
1.血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)诱导斑马鱼节间血管(ISV)，背部纵侧血管(DLAV)以及肠下静脉血管(SIV)的损伤
受精后观小时大的转基因斑马鱼Tg(fli_l =EGFP)胚胎用300nM血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)对其进行处理3个小时后，洗掉VRI溶液，并用纯净去离子水洗61-2遍，并将鱼培养在胚胎培养液中并分别在31小时，2，3天大时通过荧光共聚焦显微镜观察发现，已经形成的斑马鱼节间血管，背部纵侧血管由于VRI与处理后逐渐消失，并且形成了畸形的肠下静脉血管(图1E-G)。而0. DMSO预处理的斑马鱼对照组的节间血管，背部纵侧血管依然完整，且肠下静脉血管发育正常(图1B-D)。由此可见VRI能够引起斑马鱼的节间血管，背部纵侧血管的消失并引起肠下静脉血管发育的畸形。
受精后观小时大QShpf)的斑马鱼胚胎，拆去蛋壳，并将大部分放在60mm直径的培养皿中，加入150、300、600nM/L血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)，并放到恒温箱中培育3小时，过3小时候，拿出除去VRI溶液，并用纯净去离子水洗1-2遍，之后分装在6孔板内，每孔保证10-15个斑马鱼胚胎，每个孔为一组，并在胚胎培养液中培养M小时后，在荧光共聚焦显微镜下观察血管的形态。其中0. 的DMSO作为溶液对照(vehicle control)，每组实验最少重复三遍，结果如图2所示，随着VRI浓度越高，对斑马鱼胚胎血管所造成的损伤也就越大。其中VRI在300nM的浓度下对斑马鱼胚胎的血管就能造成显著性的损伤。
2.血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)能引起斑马鱼血管内皮细胞的凋亡
受精后观小时大QShpf)的斑马鱼胚胎，拆去蛋壳，并将其放在两个60mm直径的培养皿中，分别加入150、300nM/L血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)，并放到恒温箱中培育3小时，过3小时候，拿出除去VRI溶液，并用纯净去离子水洗1-2遍，加入胚胎培养液放到恒温箱中培育对小时，拿出并用PBS洗2-3遍，吸干后加入仲甲醛(PFA)室温放置10分钟，再用PBS清洗2遍，吸干后浸在100 %乙醇_20°C过夜，第二天用PBS清洗两次，按照试剂盒里面的指示分别加入试剂盒里面的试剂进行染色。最后在荧光共聚焦显微镜下观察，并再在通过转基因斑马鱼绿色荧光的照片与原位凋亡检测红色荧光的照片的重迭发现，红色的荧光亮点表示凋亡细胞，VRI能够特异性的引起斑马鱼血管内皮细胞的凋亡并且随着VRI浓度的越高凋亡的程度越深，且在斑马鱼节间血管(ISV)区域尤为明显(图 3)。由此可见，VRI引起斑马鱼的节间血管，背部纵侧血管的消失是由于VRI诱导该些区域的血管内皮细胞凋亡导致的。
实施例2 VRI诱导的斑马鱼胚胎血管损伤模型用于促血管新生药物的快速筛选实验毛蕊异黄酮能恢复血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)所引起的血管损伤(消失)
受精后28小时大的转基因斑马鱼Tg (f Ii-I =EGFP)胚胎用300nM/L血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)对其进行处理3个小时后，洗掉VRI溶液，并用纯净去离子水洗1-2遍，并将鱼培养在含有0. 1 % DMSO胚胎培养液中及需要筛选的药物(以毛蕊异黄酮为例)，分别加入12. 5，25，50 μ M/L毛蕊异黄酮中并分别在2，3，4天大时通过荧光共聚焦显微镜观察发现，在VRI预处理后并于0. DMSO胚胎培养液中培养的斑马鱼其节间血管，背部纵侧血管逐渐消失，并且形成了畸形的肠下静脉血管(图3 ΙΒ，ΙΙΒ，ΙΙΙΒ)。但是在VRI 预处理后并于12. 5，25，50 μ M/L毛蕊异黄酮水中培养的斑马鱼其受损的节间血管，背部纵侧血管逐渐恢复，并且肠下静脉血管发育也趋于正常，且具有剂量依赖性，并在50 μ M/L浓度下恢复达到最佳。其中0. 的DMSO作为溶液对照(vehicle control)，而在0. 1 % DMSO 处理的斑马鱼对照组的节间血管，背部纵侧血管完整，且肠下静脉血管发育正常(图4)，且每组实验最少重复三遍。从这些结果我们可以看出VRI能够引起节间血管，背部纵侧血管的损伤及肠下静脉血管发育异常，但是毛蕊异黄酮能够治疗此类损伤，使得损伤的血管逐渐恢复到正常状态。
实施例3 VRI诱导的斑马鱼基因水平的变化
实验方法=Flkl-A也称 KDRl、VEGFR2 like, Flkl-B 也称 KDR、VEGFR2, Fltl 也称VEGFR1，作为血管生长因子(VEGF)的受体被VEGF所启动而诱发细胞内对血管新生的信号的应答，而此类受体也是特异性表达在血管内皮细胞中，所以此类受体的表达可作为内皮细胞状态的一个关键的指标。该实验每组取30条受精后观小时大的野生型斑马鱼胚胎预处理300nM/L VRI 3小时后，拿出除去VRI溶液，并用纯净去离子水洗1_2 遍，之后分装在6孔板内，每孔保证30个斑马鱼胚胎，每个孔为一组，分别加入12. 5、25、 50 μ M浓度的毛蕊异黄酮，加药处理M个小时后提取总RNA，提取的试剂盒为RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)，同时提取同批次只加入0. 1 %的DMSO处理的斑马鱼胚胎作为对照， 提取的总RNA，定量后以等量的总RNA逆转录为cDNA，反转录的试剂盒为SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCRanvitrogen ，USA)，紧接着用实时定量 PCR检测血管新生基因的表达水平，此处用到的实时定量PCR系统为ABI 7500 Real-Time PCRSystem(Applied Biosystems)，检测时分别用三个血管新生的目标基因引物检测各基因的表达水平，引物分别有，Flkl-A, Flkl-B, Fltl (Applied Biosystems, USA)，而 bactinl 作为内参基因。
斑马鱼的bactinl 引物为5' -CAAGATTCCATACCCAGGAAGGA-3 ‘ (F) and5 ‘ -CAAG ATTCCATACCCAGGAAGGA-3‘ (R)(Applied Biosystems, USA).
斑马鱼的Flkl-A 引物为5 ‘ -GACCATAAAACAAGTGAGGCAGAAG-3 ‘ (F)and 5' -CTCCTGGTTTGACAGAGCGATA-3‘ (R)(Applied Biosystems, USA).
斑马鱼的Flkl-B 引物为5' -CAAGTAACTCGTTTTCTCAACCTAAGC-3 ‘ (F) and5 ‘ -G GTCTGCTACACAACGCATTATAAC-3‘ (R)(Applied Biosystems, USA).
斑马鱼的Fltl 弓丨物为5 ‘ -AACTCACAGACCAGTGAACAAGATC-3 ‘ (F)and 5' -GCCCTGTAACGTGTGCACTAAA-3‘ (R)(Applied Biosystems, USA).
该实验的结果如图5所示，VRI能显著性的降低Flkl-A，Flkl-B, Fltl3个基因的表达，再经过在毛蕊异黄酮处理后，其Flkl-A，Flkl-B, Fltl3个基因的表达重新恢复到与对照组相一致的表达值，且有剂量依赖性并在50 μ M/L的浓度效果最好。所以，根据VRI能显著性的降低Flkl-A，Flkl-B, Fltl3个基因的表达，我们也可以间接的看出其对斑马鱼内皮细胞的影响，但是毛蕊异黄酮能够逆转VRI诱导的Flkl-A，Flkl-B，Fltl 3个基因的表达下调的趋势，使其恢复到正常值。由此，进一步说明了毛蕊异黄酮能够治疗VRI诱导的斑马鱼血管的损伤。
结论
通过对斑马鱼胚胎血管的观察，凋亡的染色以及检测基因表达的实验，能够很清楚的看到，血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)能够显著性的诱导血管内皮细胞的凋亡，其在斑马鱼上的显著的特征就是诱导转基因斑马鱼Tg(fli-1 =EGFP)的节间血管 (ISV)，背部纵侧血管(DLAV)区域的血管的消失从而造成了斑马鱼血管新生的缺陷。在斑马鱼的基因表达实验中，通过检测Flkl-A，Flkl-B, Fltl三个基因的表达情况并发现，VRI能够显著性的下调这三个基因的表达，而Flkl-A，Flkl-B, Fltl这三个基因是VEGF在内皮细胞上的受体基因可作为血管内皮细胞特异性的指标，由此，该类基因表达的下调说明VRI 确实能够特异性的损伤血管内皮细胞从而抑制了斑马鱼的血管新生。
血管新生被抑制对于很多血管新生过量的疾病有帮助，比如视网膜疾病，肿瘤等等，抑制血管新生对其有一定的治疗效果，但是当血管新生不足时，比如心脑血管疾病，缺血性四肢骨折，秃顶等等就需要有促进血管新生作用的药物来进行治疗。因此，本发明建立 VRI诱导的血管损伤而造成的斑马鱼血管新生不足的模型，就是为了能够更加科学更加快速的筛选出具有促进血管新生的药物。
毛蕊异黄酮作为已证实的具有促进血管新生活性的潜在药物，用其来测试VRI血管损伤模型发现，毛蕊异黄酮能治疗VRI诱导的斑马鱼血管的损伤，使得被抑制的血管恢复正常；并上调VRI所下调的Flkl-A，Flkl-B, Fltl这三个基因的表达并使其恢复到正常值。
因此VRI诱导的斑马鱼血管损伤而导致的血管新生不足的模型，能够真实的模拟了血管新生不足类的疾病的环境，而该模型能够为筛选促进血管新生的药物提供了极其便利的方法及可信的平台。
权利要求
1.一种斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于包括以下顺序步骤(1)取受精后M-28小时大的转基因或野生型的斑马鱼胚胎拆蛋壳后；(2)加入浓度为100 600nM/L的血管生长因子受体抑制剂，造模3_4小时；(3)清洗掉血管生长因子受体抑制剂，得到斑马鱼血管损伤模型。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于所述的步骤 ⑴所述的野生型为AB品系，所述的转基因斑马鱼为Tg(fli-1 :EGFP)。
3.根据权利要求2所述的斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于所述步骤(2) 中的血管生长因子受体抑制剂为血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于所述步骤 (2)用血管生长因子受体抑制剂造模时，血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的浓度为 300-600nM/L。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于所述步骤(2) 所用的血管生长因子受体抑制剂加入二甲基亚砜(溶媒)助溶，二甲基亚砜的质量百分比浓度不大于1%。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼血管损伤模型的建立方法，其特征在于所述步骤(3) 用纯净去离子水清洗掉抑制剂，最少清洗2遍。
7.一种用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型，其特征在于所述模型由权利要求1-6中任一权利要求所述方法制得。
8.一种筛选抗血管损伤药物的方法，其特征在于包括以下顺序步骤(1)采用权利要求7所述的斑马鱼血管损伤模型作为空白对照组及受试药物组，取正常生长的且生长时间相同的斑马鱼胚胎为正常对照组，每组斑马鱼数量相等为5-15条；将所配好浓度的受试药物加入到受试药物组的水溶液(胚胎培养基)中，正常对照组和空白对照组则加入等量的溶媒的胚胎培养基；(2)给药M，48，72小时分别用荧光显微镜观察血管的形态，并且在给药M小时检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-lA，Flkl-B，Fltl)基因表达的水平的变化。
9.根据权利要求8所述的筛选抗血管损伤药物的方法，其特征在于所述步骤(2)采用实时定量链式反应(Quantitative real-time PCR)检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-IA, Flkl-B, Fltl)基因表达。
10.根据权利要求8所述的筛选抗血管损伤药物的方法，其特征在于所述步骤(1)的受试药物为化学药品、中药提取物、中药中的单体化合物、中药复方或它们的组合物。
全文摘要
本发明公开了一种用于筛选抗血管损伤药物的斑马鱼血管损伤模型及其建立方法和应用。本发明通过血管生长因子受体抑制剂对受精后的斑马鱼胚胎进行处理，得到血管损伤的斑马鱼，建立一个斑马鱼血管损伤模型，而后再用检测的药物处理斑马鱼1-3天，通过形态学观察以及实时定量PCR检测斑马鱼组织中血管内皮生长因子受体(Flk-1A，Flk1-B，Flt1)基因表达的水平来判断检测的药物对斑马鱼血管损伤的治疗效果。试验结果表明，本发明所建立的模式生物斑马鱼血管损伤模型，其造模率极高，可以模拟体内血管新生不足的环境进行快速筛选具有促血管新生类的药物，效果易于观察明显，在实验过程中用药量低，实验结果准确可重复性强。该模型可以成批量筛选潜在的药物，工作效率高。
文档编号C12Q1/68GK102499135SQ201110327420
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者李铭源, 许贝文, 黎晌 申请人:澳门大学