专利名称：一种缩短dna模板的dna测序方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术中基因测序技术领域，具体涉及一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用，尤其适合高通量DNA测序。
背景技术：
人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因 时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。目前，最为广泛应用的测序技术是Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法，传统的Sanger DNA测序法仍处于无可替代的地位，但这一方法存在通量低和价格高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，目前这一费用已经降低到大约2千万美元，因此，功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年提出了 1000美金人类全基因组测序的研究目标。2004年初，美国国立卫生院投入7千多万美元支持DNA 测序新技术的研究计划，其目标是发展10万美金的测序技术，并最终减低为1千美金。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。美国的454Life kiences公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina(Solexa)公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及AppliedBiosestems (SOLiD)公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。此外，一些基于单分子测序的高通量测序仪也开始面世。然而，所有这些高通量测序仪仪器不管是采用标记染料核苷酸的合成法，还是采用标记探针的连接法，其特点均是测序引物的不断延长。然而不管合成、还是连接测序方法，效率总不可能达到100 %，每步测序反应均要消耗掉一定的“正确”测序引物，而产生一些“错误”的测序引物，因此，随着合成(或者连接)次数的不断增加，这种累积的错误便越来越多，而测序的准确性是由正确合成(或者连接)的标记物信号给出的，于是，其测序准确性便越来越差。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是提供一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用，该方法采用循环“测序引物”的高通量测序技术，即将已经测定的DNA模板中的一段序列切割掉(缩短DNA模板)，并重新连接测序引物片段后，继续对未测定DNA模板进行序列测定，为全基因组DNAD序列分析提供一种新方法，建立准确，增加测序长度的，便宜基因组
4序列测定技术。技术方案一种缩短DNA模板的DNA测序方法，(1)引入一段包含IIS限制性内切酶识别位点的目标寡核苷酸序列作为序列测定的起点，采用合成或者连接测序方法将固定 DNA模板中的一小段序列测定；(2)停止该测序引物的测序，并加入四种dNIPs(dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)单体延伸测序引物链，使DNA模板成为双链；C3)缩短DNA模板用限制性内切酶处理预先设定包含酶识别序列的连接子，将已经测定的DNA模板中的一小段序列断裂； (4)将测序引物、且包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段，连接到上述切割后的缩短DNA模板上；(5)变性，除去未固定的DNA链，重新获得DNA模板；(6)杂交测序引物，继续对固定 DNA模板中的一小段序列进行测定；(7)重复步骤O)到(6)，直到未测定DNA模板序列测定完成；所述DNA模板中的一小段序列测定是根据酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数确定的，已经被测序的序列片段是酶识别位点切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制备过程中均需引入酶识别位点，酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数是确定的。所述酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，其断裂位点为距离识别位点的2-30 个碱基。所述酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，，最佳断裂位点为距离识别位点 8-25个碱基。缩短DNA模板的DNA测序方法在测定人基因组中的应用，步骤为(1)将人基因组用I酶在37°C处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的人全基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到人全基因组单链DNA测序模板；(3)将3’末端含有Mly I酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；(4)在DNA模板指导下，采用商业化的SOLiD连接测序试剂及其测序方法，测定所有DNA模板的前9个碱基；(5)当第9个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNIPs(dATP、dGTP、dCTP、 dTTP)单体，在DNA聚合酶的作用下，37。C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；(6)将Mly I酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA 其断裂位点为识别序列3'末端下游9或者5'末端下游11个碱基处，并用T4激酶将5末
端磷酸化；(7)将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列，所述上游引物应补齐2碱
基缺口 对应测序弓I物序列5 ‘ ... GGCGGA (N) 2 ；对应测序引物序列互补序列，ρ表示磷酸基团3' ...CCGCCT' ρ ；以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在Τ4连接酶作用下反应 0. 5小时；
(8)用0. IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA 模板。(9)重复步骤⑷，得到新模板上1-9个碱基的序列信息；(10)重复步骤⑷到(9)，进行循环测序，每重复一次增加9个碱基位置的序列测定长度；(11)将所有位置上DNA模板的碱基序列片段完成组装，得到人全基因组DNA序列。缩短DNA模板的DNA测序方法在测定大肠杆菌基因组中的应用，步骤为(1)将大肠杆菌基因组用Mme I酶在37 °C处理2小时后，超声破碎成大小为 50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到大肠杆菌基因组单链DNA测序模板。(3)将3’末端含有Mme I酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；(4)在DNA模板指导下，采用商业化的Solexa延伸测序试剂及其测序方法，测定所有DNA模板的前18个碱基；(5)当第18个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNIPs (dATP、dGTP、dCTP、 dTTP)单体，在DNA聚合酶的作用下，37。C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；(6)将Mme I酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA 其断裂位点为识别序列3'末端下游18或者5'末端下游20个碱基处，并用T4激酶将5 末端磷酸化；(7)将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列，上游引物需要补齐2碱基
缺口 对应测序引物序列5‘ ... TCCRAC(N)2 ；对应测序引物序列互补序列，ρ表示磷酸基团3' ... AGGYTGp ；以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在T4连接酶作用下反应 0. 5小时；(8)用0. IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA 模板；(9)重复步骤⑷，得到新模板上1-18个碱基的序列信息；(10)将所有位置上DNA模板的36个碱基序列片段完成组装，得到大肠杆菌基因组全基因组DNA序列。有益效果IIS限制性内切酶具有在识别位点之处降解DNA的能力。这些酶的大小约为400-650个氨基酸左右，它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。比如Mly I酶能识别序列下列特定区域，其断裂位点为识别序列3'末端下游9或者5'末端下游11个碱基处5' . . . GGCGGA(N)11". . . 3'
3' ... CCGCCT(N)9". ·· 5'而Mme I酶能识别序列下列特定区域，其断裂位点为识别序列3 ‘末端下游18或者5'末端下游20个碱基处5' . . . TCCRAC(N)20". . . 3'3' . . .AGGYTG(N)18". . . 5'根据限制性内切酶这一特点，本发明在DNA测序模板制备时，引入一段包含IIS限制性内切酶识别位点的寡核苷酸序列作为序列测定的起点，当采用合成(或者连接)测序法测定若干个碱基序列后，在聚合酶和dNIPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的作用下，测序引物剩下的单链区变为双链，在选定的限制性内切酶作用下(切割已知个数的碱基数目)，限制性内切酶位点的内切酶进行固相切割使待测模板缩短若干个碱基(对应上次序列测定的数目)。然后重新连接测序引物(该引物依然含有限制性内切酶识别位点)，按照同样的方法，进行下一轮测序反应。经过多轮这样的测序，便可以达到提高测序阅读长度的目的。因而本发明与现有技术相比，具有如下优点1.本发明的最大优点是每个测序引物测定的模板序列的长度有限，因而其测序的
准确度高。2.由于通过不断地缩短DNA模板，在保证高测序准确度的前提下，可以提高DNA序列的阅读长度。3.本发明的采用成熟的常规分子生物学技术，因而实施不存在技术问题。
图1是本发明一种缩短DNA模板的DNA测序方法的DNA序列测定示意图。图中有DNA模板载体1，未知DNA模板序列2 (其中两端分别为人工引入的连接子2_1和2_2， 且2-1中含有内切酶识别序列片段)，测序引物3，通过合成(或者连接)测序测定一段序列后测序引物的延长链4，测序引物的延伸链与与DNA模板成为双链5，内切酶识别序列片段切口 6(其断裂位点为识别序列3'末端下游M或者5'末端下游N个碱基处)，切割 DNA模板连接含内切酶识别序列片段的双链寡核苷酸序列7，缩短DNA模板8，新测序引物 9(可以和3相同，也可以不相同)。经过处理的未知DNA模板序列⑵通过5’端固定到载体(1)上，当测序引物(3)与未知完成杂交(a)后，可以采用标记核苷酸延伸(Bentley DR, Balasubramanian S， Swerdlow HP, Smith GP, et a 1.Accurate whole human genome sequencingusing reversible terminator chemistry. Nature，2008，456，53-59)、标记探针连接(Shendure J，Porreca GJ，Reppas NB，Lin X，et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterialgenome· Science，2005，309，1728-1732)、及其它测序方法(b)进行序列测定未知DNA模板序列的一小段片段(4)后，加入四种dNTPs单体，在 DNA聚合酶作用下延伸(c)测序引物链，使之与DNA模板成为双链(5)，然后用内切酶处理 (d，e)为双链DNA，使DNA模板在切口(6)断裂。将包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段 (7)，连接⑴到上述切割后的模板上；并经变性(g)，重新获得单链DNA模板⑶；重新杂交 (h)测序引物(8)，对定DNA模板(8)中的一小段序列进行测定。图2是用I酶处理人工合成寡核苷酸互补双链序列的电泳图。具体实验如下 合成如下两条人工寡核苷酸序列
5’ -Cy3-TTGTCTTTC |GGATq ATCTGCTGCAGCTCGGGCGGCGTATAGTGAGTCGTATTAGGATC C 3 ’ -AACAGAAAG CCTAC| TAGACGACGTCGAGCCCGCCGCATATCACTCAGCATAATCCTAGG两条序列完全互补，且含有I酶识别的特定区域(序列中方框黑体部分)，其中一条标记Cy3染料，以方便电泳观察。将标记序列0. 5nmol与Inmol的非标记序列杂交30分钟(放置在200微升PCR 管中加热至80度，慢慢冷至室温)，然后分成2份于PCR管中。一份加入50U的I酶于PCR管中，37°C处理2小时；一份不做任何处理。将上述I酶处理和未做任何处理的产物，分别进行电泳分析结果表明，处理后的荧光染料条带( 要比未做任何处理的条带(1)片段“短”。这一结果和与I酶识别特定序列，且其断裂位点为识别序列3 ‘末端下游9或者13个碱基处的理论结果相一致。
具体实施例方式实施例1 缩短DNA模板的连接测序法测定人基因组(1)将人基因组用I酶在37°C处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接(假定均为20个碱基)，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置。(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的人全基因组。并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到人全基因组单链DNA测序模板。(3)将测序引物(3末端含有Mly I酶能识别序列)与固定的DNA模板杂交。(4)参照附图1，在DNA模板指导下，采用商业化的SOLiD连接测序试剂及其测序方法(Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, et al. Accurate multiplex polony sequencing of anevolved bacterial genome. Science, 2005, 309,1728-1732),测定所有 DNA模板的前9个碱基。(5)当第9个碱基测定完成后，清洗反应池，加入dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)单体，在DNA聚合酶的作用下，37。C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链， 并清洗反应池。(6)加Mly I酶及其缓冲液于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3'末端下游9或者5'末端下游11个碱基处。并用T4激酶将5末
端磷酸化(7)将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列(上游引物需要补齐2碱基缺口)5' ... GGCGGA (N) 2 (对应测序弓|物序列)3' ...CCGCCT' ρ (对应测序引物序列互补序列，ρ表示磷酸基团)以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在Τ4连接酶作用下反应 0. 5小时。
(8)用0. IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA 模板。(9)重复步骤G)，得到新模板上1-9个碱基的序列信息(相当于原DNA模板10-18 个碱基位置的序列信息)。(10)重复步骤⑷到(9)，进行循环“缩短DNA模板法序，每重复一次增加9个碱基位置的序列测定长度。(11)将所有位置上DNA模板的碱基序列片段完成组装，得到人全基因组DNA序列。实施例2 缩短DNA模板的延伸测序法测定大肠杆菌基因组(1)将大肠杆菌基因组用Mme I酶在37 °C处理2小时后，超声破碎成大小为 50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接(假定均为20个碱基)，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置。(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组。并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到大肠杆菌基因组单链DNA测序模板。(3)将测序引物(3末端含有Mme I酶能识别序列)与固定的DNA模板杂交。(4)参照附图1，在DNA模板指导下，采用商业化的Solexa延伸测序试剂及其测序方法(Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, et a 1. Accurate whole humangenome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature,2008,456, 53-59)，测定所有DNA模板的前18个碱基。(5)当第18个碱基测定完成后，清洗反应池，加入dNIPs单体，在DNA聚合酶的作用下，37°C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池。(6)加Mme I酶及其缓冲液于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3'末端下游18或者5'末端下游20个碱基处。并用T4激酶将5末
端磷酸化；(7)将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列(上游引物需要补齐2碱基缺口)5' ...TCCRAC(N)2 (对应测序引物序列)3' ... AGGYTGp (对应测序引物序列互补序列，P表示磷酸基团)以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在T4连接酶作用下反应 0. 5小时。(8)用0. IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA 模板。(9)重复步骤G)，得到新模板上1-18个碱基的序列信息(相当于原DNA模板 19-36个碱基位置的序列信息)。(10)将所有位置上DNA模板的36个碱基序列片段完成组装，得到大肠杆菌基因组全基因组DNA序列。
权利要求
1.一种缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于(1)引入一段包含IIS限制性内切酶识别位点的目标寡核苷酸序列作为序列测定的起点，采用合成或者连接测序方法将固定 DNA模板中的一小段序列测定；(2)停止该测序引物的测序，并加入四种dNIPs单体延伸测序引物链，使DNA模板成为双链；(3)缩短DNA模板用限制性内切酶处理预先设定包含酶识别序列的连接子，将已经测定的DNA模板中的一小段序列断裂；(4)将测序引物、且包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段，连接到上述切割后的缩短DNA模板上；(5)变性，除去未固定的DNA链，重新获得DNA模板；(6)杂交测序引物，继续对固定DNA模板中的一小段序列进行测定；(7)重复步骤(2)到(6)，直到未测定DNA模板序列测定完成；所述DNA模板中的一小段序列测定是根据酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数确定的，已经被测序的序列片段是酶识别位点切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制备过程中均需引入酶识别位点，酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数是确定的。
2.根据权利要求1所述的缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，其断裂位点为距离识别位点的2-30个碱基。
3.根据权利要求1所述的缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，，最佳断裂位点为距离识别位点8-25个碱基。
4.缩短DNA模板的DNA测序方法在测定人基因组中的应用，其特征在于步骤为(1)将人基因组用I7OkI酶在37°C处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行 PCR反应，扩增片段化的人全基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到人全基因组单链DNA测序模板；(3)将3’末端含有MlyI酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；(4)在DNA模板指导下，采用商业化的SOLiD连接测序试剂及其测序方法，测定所有DNA 模板的前9个碱基；(5)当第9个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNIPs单体，在DNA聚合酶的作用下，37°C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；(6)将MlyI酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3'末端下游9或者5'末端下游11个碱基处，并用T4激酶将5末端磷酸化；(7)将新测序引物片段，且包含下列酶MlyI识别序列，所述上游引物应补齐2碱基缺Π 对应测序引物序列5’. . . GGCGGA(N)2 ；对应测序引物序列互补序列，ρ表示磷酸基团3， ... CCGCCT'ρ ；以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在Τ4连接酶作用下反应0. 5 小时；(8)用0.IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA模板；(9)重复步骤(4)，得到新模板上1-9个碱基的序列信息；(10)重复步骤(4)到(9)，进行循环测序，每重复一次增加9个碱基位置的序列测定长度；(11)将所有位置上DNA模板的碱基序列片段完成组装，得到人全基因组DNA序列。
5.缩短DNA模板的DNA测序方法在测定大肠杆菌基因组中的应用，其特征在于步骤为(1)将大肠杆菌基因组用MmeI酶在37°C处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000 碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；(2)将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行 PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到大肠杆菌基因组单链DNA测序模板；(3)将3’末端含有MmeI酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；(4)在DNA模板指导下，采用商业化的Solexa延伸测序试剂及其测序方法，测定所有 DNA模板的前18个碱基；(5)当第18个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNIPs单体，在DNA聚合酶的作用下，37°C反应0. 5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；(6)将MmeI酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37°C反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3'末端下游18或者5'末端下游20个碱基处，并用T4激酶将5末端磷酸化；(7)将新测序引物片段，且包含下列酶MlyI识别序列，上游引物需要补齐2碱基缺口 对应测序引物序列5’ ... TCCRAC (N)2 ；对应测序引物序列互补序列，P表示磷酸基团3’ ... AGGYTGp ； 以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在T4连接酶作用下反应0. 5 小时；(8)用0.IM NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA模板；(9)重复步骤(4)，得到新模板上1-18个碱基的序列信息；(10)将所有位置上DNA模板的36个碱基序列片段完成组装，得到大肠杆菌基因组全基因组DNA序列。
全文摘要
一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用，(1)采用合成或者连接测序方法将固定DNA模板中的一小段序列测定；(2)停止该测序引物的测序，并加入四种dNTPs单体延伸测序引物链，使DNA模板成为双链；(3)缩短DNA模板用限制性内切酶处理预先设定包含酶识别序列的连接子，将已经测定的DNA模板中的一小段序列断裂；(4)将测序引物、且包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段，连接到上述切割后的缩短DNA模板上；(5)变性，除去未固定的DNA链，重新获得DNA模板；(6)杂交测序引物，继续对固定DNA模板中的一小段序列进行测定；(7)重复步骤(2)到(6)，直到未测定DNA模板序列测定完成。
文档编号C12Q1/68GK102344967SQ201110341269
公开日2012年2月8日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者浦丹, 王文捷, 肖鹏峰, 谢宏梅, 陆祖宏 申请人:东南大学