专利名称：一种无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法
技术领域：
本发明涉及一种动物肠细胞分离和培养方法，具体涉及一种无胃温水性鱼肠细胞分离和悬浮培养方法，属于生物技术领域。
背景技术：
鱼类肠细胞为肠道主要功能性细胞，参与肠道营养物质的消化吸收、免疫屏障和应激反应等多种重要生理过程。由于神经、体液和许多类群细胞与肠细胞间存在广泛的相互作用，使体内试验研究肠细胞非常困难。而肠细胞体外培养研究模型是探讨营养物质对肠细胞营养作用机制、药物、重金属及其它有毒有害物质对肠道损伤与肠道修复机制、筛选有益鱼类肠道健康的功能性物质的理想模型。因此，依据肠细胞的生物学特点，建立体外鱼肠细胞培养研究模型，对于各相关领域的研究非常重要。细胞培养是指由活体组织，原代培养物、细胞系或细胞株经酶、机械力或化学的离散作用得到分散细胞，在体外适宜条件下，使细胞生长增殖，并保留其一定的结构和功能特性的技术。根据分散细胞的来源可分为原代培养和传代培养，前者指从来源组织直接离散获得细胞的首次培养，又叫初代培养；后者指从原代培养物、细胞系或细胞株离散的细胞， 经稀释，接种到新培养器皿内的继续扩大培养。原代培养细胞来源于新鲜动物组织。由于刚从活体组织上分离出来，具有二倍体遗传性，其代谢和功能与活体更为接近，在一定程度上反映了体内的特性。因此，原代培养模型适合营养、药物、细胞生长等研究，越来越受到重视。根据肠细胞生长培养特点，原代肠细胞培养可分为贴壁培养和悬浮培养。悬浮培养的特点是分离后的肠细胞接种后，悬浮在培养液中进行培养。但在无胃温水性鱼类上，至今仍无肠细胞悬浮培养技术。有胃冷水性鱼类的肠道结构、生理特点与无胃温水性鱼类存在很大差异，因此现有的有胃冷水性鱼肠细胞的分离方法、悬浮培养参数都无法直接应用于无胃温水性鱼类。在这种前提下，研究无胃温水性鱼类肠细胞悬浮培养方法，可为研究鱼类肠细胞营养生理和代谢、营养物质消化吸收机制提供物质基础和有效手段，意义重大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无胃温水性鱼肠细胞体外培养方法，使用该种方法能有效地实现无胃温水性鱼肠细胞的分离和悬浮培养。为了解决上述技术问题，本发明提供一种无胃温水性鱼肠细胞分离和悬浮培养方法，依次包括以下步骤1、选择体重400-600g的健康鲤鱼或草鱼，用2%乌拉坦溶液浸泡麻醉，待鱼体翻倒后，切去头部，破坏脊髓。按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，用溶液-1 (Hanks液)洗净肠道内容物。2、先将肠道一端扎住，用溶液-1充满肠道，另一端用止血钳夹住，在室温下孵育 10分钟。然后弃去溶液，以除去肠内可能残余的食糜和黏液。
3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充满肠道，两端用止血钳夹住，在20°C下，40 转/分，振荡孵育15分钟。然后将肠腔内含有肠细胞的溶液收集起来。再用溶液-2充满肠腔，两端用止血钳夹住，在20°C下，40转/分，振荡孵育15分钟。4、将收集的肠细胞悬液混合在一起，在1500 Xg冷冻离心lOmin。5、收集的细胞沉淀用溶液-3(DMEM培养液+42U胶原蛋白酶I)重新悬浮，在25°C 振荡孵化15min，肠细胞悬液经100-μ m孔径血液尼龙网过滤，在1500Xg冷冻离心lOmin。 细胞沉淀重新悬浮在溶液-4 (DMEM培养液+0. 5 %胎牛血清)中，供试验使用。6、细胞膜完整性用0. 5%台盼蓝染料排斥法检测。细胞悬液和染料等体积混合，滴加在计数板上，盖上盖玻片，静止1分钟后计数死细胞数和细胞总数，计算细胞活力。7、细胞悬液在1500Xg冷冻离心lOmin，分别测定上清液和细胞沉淀乳酸脱氢酶 (LDH)的活性。细胞沉淀的LDH活性反映细胞的代谢活力，上清液的LDH活性反映细胞膜的完整性。8、台盼蓝染色法确定细胞活力在90%以上，将细胞浓度调整为12X106cell/ml， 用于培养实验。轻轻混勻细胞悬液，取试验所需的细胞悬液数量，^rc振荡培养，70转/分， 培养总时间为MOmin。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤3)肠细胞分离的适宜EDTA浓度和时间处理包括以下内容A、分离鱼肠细胞的EDTA适宜浓度为0. 2mM,分离液与组织的适宜比例为1 10 ；B、分离的适宜温度为20°C，振荡转速40转/分，分离时间为15分钟。作为本发明的鱼肠细胞体外培养方法的改进步骤8)分离肠细胞的悬浮培养条件处理包括以下内容A、培养温度以2546°C为宜。B、使用细胞培养器皿密闭培养。C、所用培养液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素。与现有技术相比，本发明1、本发明首次提出无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法。2、本发明根据无胃温水性鱼肠道组织结构特点，摸索了最佳的鱼肠细胞分离技术。3、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员，比较顺利的完成鱼肠细胞的分离和悬浮培养。
图1分离良好的鲤鱼肠细胞。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1、选择体重500g左右的健康鲤鱼或草鱼，用2%乌拉坦溶液浸泡麻醉，待鱼体翻倒后，切去头部，破坏脊髓。按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，用溶液-1 (Hanks液)洗净肠道内容物。2、先将肠道一端扎住，用溶液-1充满肠道，另一端用止血钳夹住，在室温下孵育 10分钟。然后弃去溶液，以除去肠内可能残余的食物颗粒和黏液。3、再用溶液-2 (Hanks液+0. 2mMEDTA)充满肠道，两端用止血钳夹住，在20°C下，40 转/分，振荡孵育15分钟。然后将肠腔内含有肠细胞的溶液收集起来。再用溶液-2充满肠腔，两端用止血钳夹住，在20°C下，40转/分，振荡孵育15分钟。分离鲤鱼肠细胞的EDTA 适宜浓度为0.2mM，分离液(ml)与组织(g)的适宜比例为1 10(ml/g)；4、将收集的肠细胞悬液混合在一起，在1500 Xg冷冻离心lOmin。5、收集的细胞沉淀用溶液-3 (DMEM培养液+42U胶原蛋白酶I)重新悬浮，在25°C 振荡孵化15min，肠细胞悬液经100- μ m孔径血液尼龙网过滤，在1500 X g冷冻离心IOmi η。 细胞沉淀重新悬浮在溶液_4(DMEM培养液+0. 5%胎牛血清)中，供试验使用。6、细胞膜完整性用0. 5%台盼蓝染料排斥法检测。细胞悬液和染料等体积混合，滴加在计数板上，盖上盖玻片，静止1分钟后计数死细胞数和细胞总数，计算细胞活力。7、细胞悬液在1500Xg冷冻离心lOmin，分别测定上清液和细胞沉淀乳酸脱氢酶 (LDH)的活性。细胞沉淀的LDH活性反映细胞的代谢活力，上清液的LDH活性反映细胞膜的完整性。8、台盼蓝染色法确定细胞活力在90%以上，将细胞浓度调整为12X106cell/ml， 用于培养实验。轻轻混勻细胞悬液，取试验所需的细胞悬液数量，26°C振荡培养(培养温度以25-26°C为宜，使用细胞培养瓶密闭培养。)，70转/分，培养总时间为MOmin。所用培养液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉
ο如图1所示为本发明方法分离的鲤鱼肠细胞，多呈圆形，可见明显的两极特征；少量胞质物质丰富的粘液细胞；偶有椭圆形的红细胞。肠细胞的纯度和活力分别达到95%和 93%以上。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤Al、选择体重400-600g的健康鲤鱼或草鱼，用2%乌拉坦溶液浸泡麻醉，待鱼体翻倒后，切去头部，破坏脊髓；按常规方法将鱼体表消毒，无菌取出整个内脏，去除肠道表面的系膜组织，用Hanks液洗净肠道内容物；A2、先将肠道一端扎住，用Hanks液充满肠道，另一端用止血钳夹住，在室温下孵育10 分钟；然后弃去溶液，以除去肠内可能残余的食糜和黏液；A3、再用溶液-2充满肠道，两端用止血钳夹住，在20°C下，40转/分，振荡孵育15分钟；然后将肠腔内含有肠细胞的溶液收集起来；再用溶液-2充满肠腔，两端用止血钳夹住， 在20°C下，40转/分，振荡孵育15分钟；A4、将收集的肠细胞悬液混合在一起，在1500 Xg冷冻离心IOmin ；A5、收集的细胞沉淀用溶液-3重新悬浮，在25 °C振荡孵化15min，肠细胞悬液经 100-μπι孔径血液尼龙网过滤，在1500Xg冷冻离心IOmin ；细胞沉淀重新悬浮在溶液_4 中，供试验使用；A6、细胞膜完整性用0. 5%台盼蓝染料排斥法检测；细胞悬液和染料等体积混合，滴加在计数板上，盖上盖玻片，静止1分钟后计数死细胞数和细胞总数，计算细胞活力；A7、细胞悬液在1500Xg冷冻离心lOmin，分别测定上清液和细胞沉淀乳酸脱氢酶 (LDH)的活性；A8、台盼蓝染色法确定细胞活力在90%以上，将细胞浓度调整为12X106cell/ml，用于培养实验；轻轻混勻细胞悬液，取试验所需的细胞悬液数量，^TC振荡培养，70转/分，培养总时间为MOmin。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液-2为=Hanks液+0.2mMEDTA ；所述溶液-3为DMEM培养液+42U胶原蛋白酶I ；所述溶液_4为DMEM培养液+0. 5%胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中分离液与组织的适宜比例为 1 10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤8)分离肠细胞的悬浮培养条件处理包括以下内容使用细胞培养瓶密闭培养；所用培养液DMEM液中包含1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氢钠，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素。
全文摘要
本发明公开了一种无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法，将收集的肠细胞悬液混合在一起，在1500×g冷冻离心10min；收集的细胞沉淀用溶液-3重新悬浮，在25℃振荡孵化15min，肠细胞悬液经100-μm孔径血液尼龙网过滤，在1500×g冷冻离心10min；细胞沉淀重新悬浮在溶液-4中，供试验使用；细胞膜完整性用0.5％台盼蓝染料排斥法检测；细胞悬液和染料等体积混合，滴加在计数板上，盖上盖玻片，静止1分钟后计数死细胞数和细胞总数，计算细胞活力；细胞悬液在1500×g冷冻离心10min，分别测定上清液和细胞沉淀LDH的活性；轻轻混匀细胞悬液，取试验所需的细胞悬液数量，26℃振荡培养，70转/分，培养总时间为240min。本发明首次提出无胃温水性鱼肠细胞悬浮培养方法。
文档编号C12N5/071GK102367433SQ20111034883
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者冯琳, 刘扬, 周小秋, 姜俊, 姜维丹, 胡凯 申请人:四川农业大学