专利名称：一种汉坦病毒群的简并rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及汉坦病毒的检测技术，具体涉及涉及一种汉坦病毒群的简并RT-PCR 检测方法。
背景技术：
汉坦病毒属(Hantavirus)仅有一个病毒群，即汉坦病毒群(简称汉坦病毒)，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。根据汉坦病毒基因分子结构和抗原性的不同，将汉坦病毒至少分为34个血清型/基因型，包括汉滩型病毒(Hantaan Virus)，汉城型病毒(Seoul Virus)，普马拉型病毒(Puumala Virus)，多不拉伐型病毒(Dobrava Virus)，图拉型病毒 (Tula virus)，索托帕拉雅型病毒(Thottapalayam virus)和安第斯型病毒(Andes virus) 等。汉坦病毒能感染野生啮齿动物和人类，引发人类的肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒性肺综合症(HPS)。这些病遍及亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲等70多个国家，其流行之广， 危害之重，已成为全球性的公共卫生问题。我国汉坦病毒的感染情况更为严重，世界汉坦病毒感染每年报告的病例数大约在150,000 200，000之间，而我国发病人数则占世界报道病例数的90%以上，是受汉坦病毒危害最为严重的国家。我国流行的主要是肾综合征出血热，近十年来我国年报告发病人数一直稳定在4 6万人，而且新疫区不断出现，并时有爆发。汉坦病毒的检测方法主要有病毒分离、血清学检测方法和基因检测方法。基因检测方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，与血清学抗体检测相比在灵敏性和特异性上的都大幅度提高。目前汉坦病毒的RT-PCR检测方法中均只针对汉坦病毒中的汉滩病毒型和/或汉城病毒型使用特异性型引物进行RT-PCR检测，如授权公告号为CN101294226的发明专利，就公开了以汉滩型病毒和汉城型病毒的各基因型为目的片断设计了二对引物的试剂盒，用于检测汉滩型病毒和/或汉城型病毒；该试剂盒无法检测出汉坦病毒属内的其它病毒。虽然目前国内疫区大多数为汉滩型病毒和汉城型病毒感染，但随着进出口贸易量的增大，国外流行株(普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、图拉型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒等)传入不可避免，因些防止国外流行株传入以及未知型别病毒的发生的检测显得尤为重要，目前还未有对汉坦病毒属全病毒通用的PCR检测方法的公开报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，该简并RT-PCR检测方法不仅可以用于检测国内流行的汉滩型和汉城型病毒，还可以用于检测国外其它流行株，防止国外流行株传入国内。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种汉坦病毒群的简并RT-PCR 检测方法，包括下述步骤
a、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；
3b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒(购于Promega公司)对上述RNA进行RNA逆转录， 得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行在0.2mL印pendorf管中加入oligo d(T)15 primers(50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng(约 10 μ L)，72°C 10. min，加入 5XRT buffer4 μ L, dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反转录酶液(IOU/ μ L) 1 μ L、RNA 酶抑制剂(20U/ μ L)0. 5 μ L、 无RNA酶水1.5μ ，42τ lh，72°C IOmin ；反应产物即为后续的PCR模板；
c、PCR反应在 0. anL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 缓冲液(PCR buffer) 2. 5 μ L、浓度为25mM/ L的MgCl2溶液1. 5 μ L、浓度为IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、浓度为5U/μ L 的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L，组成PCR反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，35个循环，72°C延伸7min，得到PCR产物，4°C保存；所述上游引物溶液含有浓度为25mM/ L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列为GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有浓度为25mM/L的引物G2，所述引物G2的核苷酸序列为 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；其中r为嘌呤，可以是g或a，y为嘧啶，可以是 c或t/u，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它；
d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用1-1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现478bp大小片段的条带，则为汉坦病毒群。(以上PCRbuffer、MgCl2, dNTP液、Taq酶液等反应试剂均购自大连宝生生物，引物由上海生工合成。上述引物Gl、G2是根据Genbank已公布12个基因型病毒株L片段全片段基因设计弓I物对，包括 Dobrava-Belarade viru strain D0BV/Ano-Poroia/Af 19/1999, Hantaan virus strain 76-118,Seoul virus 80-39, Hantavirus zlO,Sin Nombre virus(NM H10) ,Tula virus strain Tula/Moravia/5302v,Andes virus strain Chile-9717869,Puumala virus strain Samara-49/CG/2005,Thottapalayam virus virus strain VRC 66412,Amur virus Khekhtsir/AP209/2005 ,Prospect Hill virus PH-l,Rio Mamore virus HTN—007。 将蛋白序列以FASTA格式保存，将下载的FASTA格式的氨基酸序列信息输入http:// blocks, fhcrc. org/codehop. html进行Block比对，得到高度保守的连续氨基酸区域。使用 CodeHop引物搜索，常规方法筛选合适上下游引物。要求简并度低，上下游引物位置间距在 500bp左右。利用primer和oligo软件进行引物分析，得到上述1对简并杂合寡核苷酸引物(引物Gl和引物G2)，通过Megalian与Genbank中现有L全片段毒株共52株比对，理论上均可得到478bp的扩增产物，国内外尚无对于汉坦病毒属通用引物的研究报道。与现有技术相比，本发明的优点在于一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为GCAACAGCAA CATGGTTTca rtaytayac的引物Gl，下游引物溶液含有序列为CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc的引物G2，引物Gl和引物G2是由5 ‘端非兼并共有序列夹和根据保守氨基酸设计的很短的3 ‘端的核心简并区(cartaytayac或arnccyttytc)组成， 扩增产物序列长度为478bp ；引物中5丨端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下能稳定3 ‘兼并核心区与模板结合作用，允许在较高退火温度下进行，提高了兼并PCR反应的特异性，可以扩增检测汉坦病毒属内各类病毒，如汉滩型病毒、汉城型病毒、普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止国外流行株传入国内，也能对与扩展基因同源的未知病毒进行检测，并可以对扩增的目标片段进行测序，所获得的生物信息学数据可以用于汉坦病毒的分子流行病学调查研究。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1、RT-PCR检测汉滩型病毒
1、总RNA提取Vero细胞用5%灭活小牛血清DMEM37°C培养，常规消化传代培养成单层后，接种汉坦病毒76-118株病毒(汉滩型，浙江省疾病控制预防中心惠赠)，吸附2小时后用0. 5%小牛血清DMEM (购自Hyclone)维持液放置于37°C CO2培养箱内培养。7_10天中 IFA检测出现阳性后收获细胞，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA作为阳性RNA (具体提取方法依说明书)。用微量分光光度计测量RNA浓度和纯度，0D260/280 ^ 1.9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染，取50ng进行RT-PCR反应；
2、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述阳性RNA进行RNA逆转录，具体方法为 在 0.2mL 印 pendorf■管中加入 oligo d (T)15 primers (50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng (约 10μ L),72°C lO.min，加入 5 X RT buffer4 μ L、dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反转录酶液(10U/yL) IyL, RNA 酶抑制剂(20U/y L) 0.5yL、无 RNA 酶水 1. 5 μ L, 42 °C lh, 72 °C IOmin ；反应产物即为后续的PCR模板；
3、PCR反应在 0. anL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer2. 5 μ L、MgCl2 溶液(25mM/ L) 1· 5 μ L、dNTP 液(10mM/L) 0· 5 μ L、Taq 酶液(5U/ μ L) 0· 5 μ L、上游引物溶液(引物 Gl 浓度为25mM/L) 1 μ L、下游引物溶液(引物G2浓度为25mM/L) 1 μ L，PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L，组成PCR反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，;35个循环，72°C延伸7min，4°C保存PCR产物；
4、琼脂糖凝胶电泳将PCR产物用1-1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析。结果汉坦病毒76_118株Vero细胞培养物出现478bp大小片段的条带，测序结果序列如SEQ ID NO :3所示。RT-PCR方法灵敏性试验用分光光度计检测提取汉坦病毒76-118株感染的Vero 细胞RNA浓度为85. 6ng，将RNA用foiase-free Water 10倍梯度稀释，按照实施例1的步骤 1-4的方法用G1/G2引物对扩增进行检测。结果显示本检测方法可以检测出的最高稀释度为10_3，相当于85. 6pg核酸的病毒RNA。RT-PCR方法特异性试验用汉坦病毒76-118株RNA、甲型Hmi流感病毒RNA、，柯萨奇病毒RNA、流行性乙型脑炎RNA，正常Vero细胞RNA，作为检测对象，按照实施例1的步骤1-4的方法用G1/G2引物对扩增进行检测，结果只有汉坦病毒76-118株核酸扩增产物在 478bp出现一条特异性条带外，甲型Hmi流感病毒、柯萨奇病毒、流行性乙型脑炎病毒及正常Vero细胞RNA扩增产物均未见特异性核酸条带。实施例2、RT-PCR检测小鼠的汉坦病毒
对2008年-2009年大榭港区收集253只小鼠，用乙醚麻醉后颈椎脱白处死，取肺组织 10-25mg，勻浆后用RNA提取试剂盒进行肺组织总RNA提取(具体提取方法依说明书)，用微量分光光度计测量RNA浓度和纯度，0D260/280彡1.9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染，取50ng进行RT-PCR反应；然后按实施例1的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行 PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明在检测253份鼠肺样本，其中2份扩增得到478bp大小片段的条带。检测结果与使用卫生部公布的《全国肾综合征出血热检测方案 (试行)》结果一致。一份条带送上海英俊测序，测序结果序列如SEQ ID NO :4所示，序列比对后鉴定为汉滩型病毒。实施例3、RT-PCR检测汉城型病毒
与实施例1步骤1-4基本相同，所不同的只是接种的是汉坦病毒80-39株病毒(汉城型，浙江省疾病控制预防中心惠赠)，检测后汉坦病毒80-39株Vero细胞培养物出现478bp 大小片段的条带，测序结果的序列如SEQ ID N0:5所示。实施例4、RT-PCR检测普马拉型病毒阳性质粒
人工合成Puumala virus strain Sotkamo核酸(如SEQ ID NO:6所示序列)片段(大连宝生生物合成)，连接至PMD18-T载体(购自上海生工)，转化至DH5ci大肠杆菌(购自上海生工)，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生工)提取质粒作为阳性RNA和阴性RNA(若病毒用RNA提取试剂盒提取RNA)，然后按实施例1的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性RNA出现478bp大小片段的条带，阴性RNA无条带出现。实施例5、RT-PCR检测多不拉伐型病毒阳性质粒
人工合成 Dobrava-Belgrade virus strain Ano-Poroia/Af 19/1999 核酸(如 SEQ ID N0:7所示序列)片段(大连宝生生物合成)，连接至pMD18-T载体，转化至DH5a大肠杆菌， 挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生工)提取质粒作为阳性RNA和阴性RNA(若病毒用RNA提取试剂盒提取RNA)，然后按实施例 1的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性 RNA出现478bp大小片段的条带，阴性RNA无条带出现。实施例6、RT-PCR检测安第斯型病毒阳性质粒
人工合成 Andes virus strain Chile-9717869 核酸(如 SEQ ID N0:8 所示序列)片段 (大连宝生生物合成)，连接至PMD18-T载体，转化至DH5ci大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生工)提取质粒作为阳性 RNA和阴性RNA (若病毒用RNA提取试剂盒提取RNA)，然后按实施例1的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性RNA出现478bp大小片段的条带，阴性RNA无条带出现。实施例7、RT-PCR检测索托帕拉雅型病毒阳性质粒
人工合成 Thottapalayam virus strain VRC-66412 核酸(如 SEQ ID N0:9 所示序列) 片段(大连宝生生物合成)，连接至PMD18-T载体，转化至DH5ci大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生工)提取质粒作为阳性RNA和阴性RNA (若病毒用RNA提取试剂盒提取RNA)，然后按实施例1的步骤2进行 RNA逆转录，步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性RNA出现478bp大小片段的条带，阴性RNA无条带出现。从上述实施例说明本发明的RT-PCR检测方法对汉坦病毒群的汉滩型病毒、汉城型病毒、普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒有效，同理也对该汉坦病毒群的图拉型病毒等有效，是一种通用的汉坦病毒属种类的检测方法。在此不一一列举其它病毒型的检测结果。
权利要求
1. 一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，其特征在于包括下述步骤a、RNA提取用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行；c,PCR反应PCR反应体系为10XPCR缓冲液2. 5 μ L、浓度为25mM/ L的MgCl2溶液 1. 5 μ L、浓度为IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L ；反应条件为94°C预变性5min, 94°C变性30s, 52°C退火30s, 72°C延伸lmin, 35个循环，72°C延伸7min,得到的 PCR产物4°C保存，所述上游引物溶液含有浓度为25mM/L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列为GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有浓度为25mM/L的引物 G2，所述引物 G2 的核苷酸序列为 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用1-1. 5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现478bp大小片段的条带，则为汉坦病毒群。
全文摘要
本发明公开了一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为GCAACAGCAACATGGTTTcartaytayac的引物G1，下游引物溶液含有序列为CTTCTTCATTCATATTTCCATGCarnccyttytc的引物G2，引物中5＇端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下能稳定3＇兼并核心区与模板结合作用，提高了兼并PCR反应的特异性，可以扩增检测汉坦病毒属内各类病毒，如汉滩型病毒、汉城型病毒、普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止国外流行株传入国内，也能对与扩展基因同源的未知病毒进行检测。
文档编号C12Q1/68GK102382906SQ20111035416
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者胡群, 谢东华, 郭利平, 韩辉, 马思杰 申请人:中华人民共和国大榭出入境检验检疫局