杀灭ndm-1肺炎克雷白氏菌的方法

文档序号:399887阅读:612来源:国知局
专利名称:杀灭ndm-1肺炎克雷白氏菌的方法
技术领域
本发明涉及消毒灭菌领域,特别是涉及杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌(NDM-l-positive Klebsiella pneumoniae)的方法。
背景技术
快速于世界各地散播的NDM-1 (New Delhi Metallo-β-lactamase)阳性病原菌已对公共卫生与临床治疗造成极大困扰与威胁,如何有效避免此类病原菌的散播并将其杀死成为首要议题。日前,于台湾大学所发展出来的病毒崩(VirusBom)可以快速且有效地杀死不同的病原菌,包含病毒与细菌,在公共卫生防治上有其应用的潜能。因此,我们想进一步探讨是否病毒崩可以有效杀死与避免NDM-1阳性病原菌的散播。

发明内容
本发明的目的之一在于提供了杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌的方法,其中使用病毒崩。病毒崩的浓度在300ppm至IOOOppm之间。更进一步的,病毒崩的浓度是300ppm。本发明的另一个目的在于提供了病毒崩在杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌中的应用。病毒崩的浓度在300ppm至IOOOppm之间。更进一步的,病毒崩的浓度是300ppm。根据本发明,病毒崩可以直接杀死从台湾所分离出来的NDM-1阳性的肺炎克雷白氏菌。当300ppm的病毒崩在室温下与此细菌直接反应,可以在短短一分钟内快速杀死它。电子显微镜与荧光染色分析显示病毒`崩的毒杀机制是经由改变NDM-1肺炎克雷白氏菌的细胞壁结构而导致其死亡。实验表明,当此细菌处在含有不同浓度病毒崩的培养液环境下培养,就算高达300ppm的病毒崩并不会明显改变其生长,但却可以有效地抑制其生物膜(Biofilm)的形成,甚至已经形成的生物膜在300ppm的病毒崩直接处理之后,生物膜可以有效地被瓦解。因此,从目前的结果显示,病毒崩可以快速杀死带有NDM-1的肺炎克雷白氏菌,并通过抑制生物膜的形成来避免此类细菌的散播与附着,因此未来有极大的潜能应用于医院与公共场所的卫生防护。


图1是表明病毒崩对NDM-1的肺炎克雷白氏菌具有毒杀作用的不意图。图1A表示NDM-1的肺炎克雷白氏菌在所标示浓度的病毒崩和I %乙醇中(控制组)培养标定时间所长出的菌落;图1B表示NDM-1的肺炎克雷白氏菌在所标示浓度的病毒崩和I %乙醇中(控制组)培养标定时间后存活的细菌数(CFU/ml),ND表示未侦测到菌落数;图1C显示通过扫描式电子显微镜观察NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB,控制组或300ppm病毒崩中生长状况;
图1D显示经LIVE/DEAD BacLight Kits (Invitrogen)染色后,利用正立突光显微镜(Leica, Germany)观察NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB,控制组或300ppm病毒崩中死活比例;图2是表明病毒崩抑制具有NDM-1的肺炎克雷白氏菌的生物膜的形成的示意图;图2A表不利用分光光度计测定630nm的吸光值(OD63tl)用于定量分析生物膜;图2B表示利用分光光度计测定测定0D_的吸光值用于表示细菌生长密度;图2C表示利用分光光度计测定测定630nm的吸光值(OD63tl)用于定量分析NDM-1的肺炎克雷白氏菌在未处理组,控制组和病毒崩组中的生物膜。
具体实施例方式1.方法与材料细菌菌株与培养条件带有NDM-1的肺炎克雷白氏菌是从第一个在台湾疾病管制局(Taiwan CDC)所报导案例的38岁台湾男子所分离出来的(Wu et al.)。一般肺炎克雷白氏菌的培养是接种单一菌落在Luria Broth (LB,Difco,LB培养基)培养液中,然后在37°C隔夜振荡培养。为了获取快速生长期阶段的细菌,将隔夜培养菌液1: 100稀释于新的LB培养液中,震荡培养至细菌密度在600nm吸光值(0D600)约在0.3至0.5左右,通过离心方式(8000rpm、IOmin)收集此阶段的细菌。经过无菌的phosphate buffer saline (磷酸盐缓冲液,PBS, ρΗ7.4)洗涤I次后,回溶在所指定的溶液中进行下阶段的实验。化学药品病毒崩(VirusBom)由台湾蔓妮艺能有限公司(MoneyMarketing Corporation,Taiwan)所提供。病毒崩的高浓度原始溶液为lOOOppm,后续在不同溶液中所配制的不同浓度病毒崩都由此原始溶液序列稀释得来。病毒崩的原始溶剂以I %乙醇溶液为基础。D-glucose从美国Sigma公司所购买。Luria Broth从美国Difco公司购买。实施例11.病毒崩的毒杀作用将带有NDM-1的肺炎克雷白氏菌在LB培养液中培养至快速生长期阶段。IX IO8菌落数(colony-forming unit, CFU)的NDM-1的肺炎克雷白氏菌经由离心(离心速度8000rpm、IOmin)并去掉上清液之后,回溶在100 μ I所标示浓度(ppm)的病毒崩溶液或1%乙醇溶液(控制组)中,混合均匀后,立即或在室温培养所标示的时间长度。利用无菌的PBS (pH7.4)序列稀释之后,取出稀释液均匀涂抹于LB固态培养基上,在37°C隔夜培养,观察所长出的菌落(如图1A所示)。并计数所形成的菌落数,图1B表示各组存活的细菌数,各组所存活的菌落数以CFU/ml表示,重复两次独立实验,计算其平均值与标准差,相对于控制组的数据,利用Student’ s t-test(T检验)计算统计差异。…*,P < 0.0001;ND(non-detected)表示未侦测到菌落数。实验结果显示300ppm的病毒崩在室温下与此细菌直接反应,可以在短短一分钟内直接快速杀死从台湾所分离出来的NDM-1阳性的肺炎克雷白氏菌。因此病毒崩对NDM-1的肺炎克雷白氏菌具有毒杀作用。2.扫描式电子显微镜影像分析
如同病毒崩毒杀作用的方法描述,经过LB(未处理),1%乙醇溶液(控制组),或300ppm病毒崩(VB)处理的细菌,经离心收集之后,进行扫描式电子显微镜分析,其中样品处理是参照先前报导的操作步骤(Lembke et al.,2006)。图像观察与撷取是利用长庚大学显微镜中心所提供的扫描式电子显微镜(Hitachi S-3000N, JAPAN)来处理。所呈现的图片为10000倍放大倍数,Scale bar,5 μ m。结果显示在图1C中。细菌存活分析利用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits (Invitrogen)来分析经由病毒崩处理后之细菌是否 因为细胞壁结构改变而呈现死亡。参照所提供的方法,离心收集下来的细菌经由SYTO 9和propidium iodide (PI) (I: I混合)染色后,移至1-1.5%agarose(琼脂糖)平面上,利用正立荧光显微镜(Leica DM2500)分析,图像呈现明视野(differential interference contrast, DIC),与突光视野(13 or TX)的图像,影像掘取与后制经由 Spot RT 3 Slider charge-coupled device (CCD) camera (DiagnosticInstruments Inc.)与 Spot (Diagnostic Instruments Inc.)。Scale bar,5iim0 结果显示在图1D中。实施例2生物膜贴附实验生物膜贴附实验是根据先前Lin et al.(Lin et al.)的步骤,经过简单修饰之后来进行。取LB隔夜培养的菌液(4X IO6),经由离心并去掉上清液之后,以1: 100稀释于含有0.2% glucose (葡萄糖)及不同浓度(ppm)的病毒崩或I %乙醇(控制组)的LB培养液(IOOul)中进行回溶。混合之后,分装至polyvinylchloride (PVC)材质的96孔盘之中,在37°C及50rpm转速培养24小时。上清液移至新的透明的96孔盘(NUNC,平底),利用分光光度计计数在600nm的吸光值(0D_),以表不在含有不同浓度病毒崩之培养液之下,细菌的生长密度(如图2B所示)。取出上清液后的各孔,经由PBS(pH7.4)洗过三次,室温烘干10分钟,最后加入150μ I的1%结晶紫(crystal violet, Sigma)溶液至各孔中,室温静置20分钟进行染色,去掉结晶紫上清液并以二次水洗涤三次后,室温烘干10分钟,之后以照相机撷取影像以显现生物膜形成的外观(下半部分)。之后加入200 μ 195%乙醇至各槽中,反应10分钟以溶解出所染上的结晶紫,以二次水校正至I毫升之后,利用分光光度计测定630nm的吸光值(OD63tl)对生物膜(上半部分)进行定量分析以表示生物膜贴附程度,如图2A所述。经过三次独立实验之后,计算出平均值与标准差,利用Student’s t_test计算各实验组相对于控制组之统计差异P值。*,P < 0.05广,P < 0.01。为了了解是否病毒崩具有崩解已形成之生物膜的能力,NDM-1阳性的肺炎克雷白氏菌进行如同图2A所描述的生物膜贴附实验步骤。参考图C所示,带有NDM-1的肺炎克雷白氏菌在含有0.2%葡萄糖LB培养液中形成生物膜之后,完全未作任何处理的控制组(UT)保持在原先培养液之中;实验组则是在去掉上清液之后,加入200μ I的300ppm病毒崩溶液(VB)或1%乙醇溶液(mock,控制组),静置培养所标示的时间之后,去除各组的上清液,利用如同图2B的相同的洗涤与染色步骤,进行拍照与定量。生物膜形成的外观如图所示(下半部分)。生物膜的定量以OD63tl来表示,进行三次独立试验。从三次独立实验中得到平均值与标准差,相对于未处理之控制组(UT),利用Student’s t_test计算各实验组相对于控制组之统计差异P值。*,P<0.05;*,P<0.01。图2的结果显示病毒崩抑制NDM-1的肺炎克雷白氏菌的生物膜形成。因此本发明证实病毒崩(VirusBom)具有直接毒杀带由NDM-1的肺炎克雷白氏菌的功能。重要的是,该细菌的生物膜形成能力可有效的被病毒崩所抑制。因此,本发明人相信病毒崩所拥有的生物膜抑制和毒杀作用在未来会具有极大的应用价值。参考文献Lembke , C.,A.Podbielski,C.Hi dal go-Gras s,L.Jonas, Ε.Hanski &B.Kreikemeyer, (2006) Characterization of biofilm formation by clinicallyrelevant serotypes of group A streptococci (通过A组链球菌的临床相关血清型鉴定生物膜的想成).Appl Environ Microbiol 72:2864-2875.
Lin, C.S.,J.T.Horng,C.H.Yang,Y.H.Tsai, L.H.Su,C.F.Wei, C.C.Chen,S.C.Hsieh, C.C.Lu & H.C.Lai, Rs s AB-FI hDC-Sh I BA as a major pathogenesis pathwayin Serratia marcescens (在粘质沙雷菌中RssAB-FlhDC-ShlBA作为主要的致病途径).1nfect Immun 78:4870-4881.
Wu, H.S.,T.L.Chen, 1.C.Chen, M.S.Huang, F.D.Wang, C.P.Fung & S.D.Lee,First identification of a patient colonized with Klebsiella pneumoniae carryingblaNDM-1 in Taiwan (台湾携带blaNDM_l的肺炎克雷白氏菌的病人的首次鉴定).J ChinMed Assoc 73:596_598.`
权利要求
1.一种杀灭 NDM-1 肺炎克雷白氏菌(NDM-l-positive Klebsiella pneumoniae 或NDM-1-Producing Klebsiella pneumoniae)的方法,其中使用病毒崩。
2.根据权利要求1所述的方法,其中使用病毒崩的浓度在300ppm至IOOOppm之间。
3.根据权利要求1所述的方法,其中使用病毒崩的浓度是300ppm。
4.一种病毒崩在制备杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌的试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其中病毒崩的浓度在300ppm至IOOOppm之间。
6.根据权利要求4所述的应用`,其中病毒崩的浓度是300ppm。
全文摘要
本发明涉及一种杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌的方法,其中使用病毒崩。另外本发明还涉及病毒崩在制备杀灭NDM-1肺炎克雷白氏菌的试剂中的应用。
文档编号C12N1/20GK103103144SQ20111035426
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者王兴娴 申请人:蔓妮艺能有限公司
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