牡蛎折光马尔太虫lamp检测试剂盒的制作方法

文档序号:399917阅读:244来源:国知局
专利名称:牡蛎折光马尔太虫lamp检测试剂盒的制作方法
技术领域
本发明涉及牡蛎折光马尔太虫检测领域,尤其是一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。
背景技术
折光马尔太虫(Marteilia refringens)对牡蛎养殖的危害较大,可引起贝类消瘦、消化道变色、停止生长并死亡,大洋洲和欧洲等国家其感染现象普遍存在。折光马尔太虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等,这些方法费时费力,缺乏专一性,在实际工作中具有一定的局限性。目前,虽已建立起折光马尔太虫PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法,其检测敏感性也比较高,但是常规PCR需要使用 PCR仪和进行凝胶电泳,荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等,,因而难以适应基层现场检测需要。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,以满足基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,该试剂盒含有以下试剂反应液A 含有IOX等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物l、20uM的内引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的环引物 1、20碰的环引物2、511甜菜碱、6251^钙黄绿素和12. 5mM氯化锰;IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ;内引物 1 序列为 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA,内引物 2 序列为 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT,外引物1 序列为 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC,外引物2 序列为 CGAGTAAGTGCATGCACAAC,环引物1 序列为 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG,环引物2 序列为 ACCCACAACTTCGATAGCCCC。反应液A每管M μ L,其组成为2. 5ul 10 X等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物2,lul 5M甜菜碱、Iul 625μΜ钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和2. 5ul双蒸水。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据折光马尔太虫共有的基因保守区(见序列表SEQ. ID. No. 1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物,由此发明了用于快速检测牡蛎折光马尔太虫的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。 应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎折光马尔太虫检测方法,仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增,即可检测出牡蛎折光马尔太虫。该法无需昂贵的PCR 仪只需普通水浴锅,却比PCR检测有更高的灵敏度,且不必通过凝胶电泳观察结果,操作简单而快速,特别适用于基层现场检测。另外,常规的LAMP方法,需要在反应结束后开盖加入STOR Green I或Gene Finder染料来显色,容易造成假阳性一方面,反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性;另一方面,SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此,本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料,即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入;而且,钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色,避免了 STOR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题,所以具有更好的特异性。


图1是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。图1中1折光马尔太虫,2单孢子虫,3副溶血弧菌,4溶藻弧菌,5派琴虫,6河弧菌,7贝类组织。图2是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。图2中1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫DNA 20ng/管,2ng/管, 200pg/ 管,20pg/ 管,2pg/ 管,200fg/ 管,20fg/ 管,2fg/ 管。图3是PCR方法检测牡蛎折光马尔太虫敏感性试验结果图。图3中M为IOObp DNA ladder, 1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫 DNA20ng/ 管,2ng/ 管,200pg/ 管,20pg/ 管,2pg/ 管,200fg/ 管,20fg/ 管,2fg/ 管。
具体实施例方式一、牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的配制反应液A 每管M μ L,其组成为2. 5ul 10 X等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物2,lul 5M甜菜碱、Iul 625μΜ钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和2. 5ul双蒸水。其中,IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100。内引物 1 序列为 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA (见序列表 SEQ. ID. No. 2),内引物 2 序列为 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT (见序列表 SEQ. ID. No. 3),外引物1 序列为 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC(见序列表 SEQ. ID. No. 4),
外引物2 序列为 CGAGTAAGTGCATGCACAAC(见序列表 SEQ. ID. No. 5),环引物1 序列为 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG(见序列表 SEQ. ID. No. 6),环引物2 序列为 ACCCACAACTTCGATAGCCCC(见序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎折光马尔太虫的方法(以下简称LAMP检测法)1、组织样品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒,型号DP3M-0;3)提取组织DNA,浓度能达到20ng/ul。2、牡蛎折光马尔太虫LAMP反应以提取的牡蛎折光马尔太虫DNA为模板,在装有MyL反应液A管中加入1 μ L待检DNA构成25ul反应体系;LAMP反应程序如下61°C 60min,然后80°C 5min。直接用肉眼观察颜色变化,如颜色变为绿色,则说明样品中含有牡蛎折光马尔太虫;如果颜色为黄色, 说明待检样品不含有牡蛎折光马尔太虫。三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验1.特异性试验分别以折光马尔太虫、单孢子虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组织的核酸为模板,按照前述牡蛎折光马尔太虫LAMP反应体系和条件进行反应。结果见图1,对牡蛎折光马尔太虫的检测为阳性结果(显示绿色),而对单孢子虫、 副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组织的检测均为阴性(显示黄色)。2.敏感性试验将牡蛎折光马尔太虫DNA按10倍递增稀释成20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、 20fg、2fg。牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法检出限与PCR对比牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。牡蛎折光马尔太虫PCR反应组成如下在25ul的反应体系中含10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1,牡蛎样品模板 DNA 1 μ L, 25 μ mol/L 的上、下游引物(上游引物为 Marteilia 1 5-TACGACCGTAGCCTTTCCAC-3 ;下游引物为 Marteilia 2 5-CGCCTCTACTCTTCTCCCAA-3)各 0. 5 μ LddH2O 补足 25 μ L。扩增程序为94°C变性5分钟,然后进入94°C变性1分钟,57°C退火1分钟,72°C延伸1分钟的循环, 共进行35个循环,最后再经72°C延伸10分钟。牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果,结果见图2。将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳,然后进行溴化乙锭染色,结果见图3。牡蛎折光马尔太虫 LAMP检测方法的检测限为20fg,而常规PCR的检测限为2pg,LAMP方法敏感性比常规PCR 高100倍。
权利要求
1.一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,其特征在于该试剂盒含有以下试剂 反应液A 含有IOX等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环引物1、 20碰的环引物2、511甜菜碱、625 4 11钙黄绿素和12. 5mM氯化锰;所述IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM 硫酸镁和曲拉通X-100 ;所述内引物 1 序列为 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA, 所述内引物 2 序列为 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT, 所述外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC, 所述外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC, 所述环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG, 所述环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC。
2.根据权利要求1所述的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,其特征在于所述反应液 A每管M μ L,其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、l.Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM 的内引物 1、0. 25ul 20uM 的内引物 2、2ul 20uM 的外引物l、2ul 2011] 的外引物2、1111 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物2,Iul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和2. 5ul双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,它采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据折光马尔太虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明的LAMP检测试剂盒,仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增,即可检测出牡蛎折光马尔太虫,解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷,具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单,特别适于基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。
文档编号C12Q1/68GK102559867SQ20111035651
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刘加波, 庞耀珊, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所
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