专利名称：一种制备转基因猪精子的方法
技术领域：
本发明涉及ー种制备转基因猪精子的方法，特别涉及磁性纳米颗粒介导的制备转基因猪精子的方法。
背景技术：
转基因技术开始于20世纪80年代，目前，转基因技术主要有显微原核注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干細胞介导法，体細胞核移植技木，精子载体法，胞浆内单精子注射法，卵母細胞载体法等。精子载体法是将精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，并使外源DNA整合到染色体中，从而使外源基因进入子代的基因组中目前，应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的体外精子转染法和体内精子转染法体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法，体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法；体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、 睾丸注射转染法等。1971年，Bracket等首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力，并将外源DNA在受精时携带进入卵母細胞。1992年，Lavitrano等应用此法得到阳性转基因小鼠，并发现成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力，其吸收区域是具有特异性的，该区域位于精子头部的顶体后区(post-acrosomal region)，即靠近精核的区域。沈新明等直接用人巨細胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精細管内，最后通过与雌鼠交配，成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。袁进等报道向通过向曲精細管内注射外源DNA，然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理，以使外源基因进入睾丸生精细胞然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一組的阳性检测率达25%。Sien 等则将处理方法更为简化，首先直接向雄兔睾丸内注射携帯绿色荧光表达的外源DNA及ニ 甲基亚枫的介质，使DNA能够进入睾丸細胞和生精細胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这ー转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法的结果。李碧春等以重组的緑色荧光蛋白基因为标记，首次在家鸡上通过采用公鸡睾丸内转染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和体外转染SSCs再移植的方法成功地生产出了转基因鸡，并且在家鸭和家鸡上转染功能基因进行验证，结果均说明该方法无需特殊的仪器要求，即可完成转染外源基因的过程，方法简单，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生产转基因鸡群，该方法的建立在家禽上意义重大，突破了制约家禽转基因生产的瓶颈，解决了家禽转基因难的问题，特别是体外转染移植的成功，不仅解决了家禽转基因难的问题，而且为成体干細胞的应用开辟了更广阔的应用前景。精子载体法中精子孵育前的预处理通常使精子的受精能力下降，于是许多学者尝试借鉴医学上的辅助生殖技术ICSI使处理精子受精，精子胞质内显微受精技术是借助显微操作仪将ー个精子或生精細胞直接注入卵母細胞质内，从而完成受精的过程。它降低了对精子各种指标的要求，使各种在体内外不可能发生正常受精的卵子受精，同时可以避免多精子受精，也为研究异种间受精提供了有效的途径1999年。美国科学家Perry等W4] 人首次将ICSI技术应用于动物转基因领域，成功地获得了转基因小鼠随即，研究者们分别在猕猴猪上也进行ICSI转基因的尝试，胚胎转基因阳性率也很高，然而这些实验最终并没有得到出生的转基因动物2006年，Kurom等把精子与携帯有人白蛋白(hALB)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列片断共孵化，通过ICSI方法生产的胚胎移植后生产出ー头含有hALB和GFP基因的转基因小猪Garc' a-Va' zquez等将猪的精子经不同方法处理，发现经冻融处理(frozen-thawing，FT)，不加冷冻保护剂速冻处理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)处理过的精子与新鲜的精子相比，它们结合外源DNA的能力明显增強，但其发育能力降低QF和ΤΧ-100处理精子所造成精子細胞膜的损伤与FT造成的损伤更能促进精子与外源DNA地结合实验还发现，用新鮮的精子与用FT和ΤΧ-100处理的精子经ICSI发育的胚胎中，EGFP表达的胚胎阳性率相近(分别为 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而经 QF 处理过的精子，EGFP 胚胎的阳性率明显提高(80. 43士5. 91%)。这表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起着至关重要的作用，经处理过的精子細胞膜更有利于外源DNA与精子染色体结合，但经QF和ΤΧ-100 处理，可能严重损伤精子的細胞核，引起DNA破碎，或导致染色体的破损，从而对胚胎将来的发育有害。目前，转基因技术主要有DNA显微注射法、胚胎干細胞介导法、逆转录病毒载体法、精子载体法等。用这些方法己能有效地将外源基因导入靶細胞内，并获得了相应的转基因动物。这些技术的成功运用掲示了生产携带有外源DNA的动物是可能的，但是这些基因转移方法也存在某些局限性。如显微注射法操作程序复杂、对胚胎损伤大，对技术、设备要求高，特别是在牛羊猪等有开发应用价值的大型哺乳动物上的低效率(低于)，极大地制约了该技术的应用前景；逆转录病毒载体法虽然基因转移的效率较高，但是基因插入是随机的，且逆转录病毒载体的容量有限，仅能携带小于IOKb的外源DNA片段，而且逆转录病毒主要感染早期胚胎的活跃分离期細胞，因而获得的多为嵌合体动物，对于转基因动物的下游筛选、培育、建系带来很大的人力、物力、财カ负担；此外，逆转录病毒易将病原体基因序列引入宿主基因组，动物的生物安全性受都到质疑。而精子载体法稳定性较差，可重复率较低。普通的睾丸注射法由于直接注射载体质粒，转基因效率较低，且结果不稳定。精子载体法是将精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，并使外源DNA整合到染色体中，从而使外源基因进入子代的基因组中目前，应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的体外精子转染法和体内精子转染法体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法，体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法；体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、 睾丸注射转染法等。1971年，Bracket等首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力，并将外源DNA在受精时携带进入卵母細胞。1992年，Lavitrano等应用此法得到阳性转基因小鼠，并发现成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力，其吸收区域是具有特异性的，该区域位于精子头部的顶体后区(post-acrosomal region)，即靠近精核的区域。沈新明等直接用人巨細胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精細管内，最后通过与雌鼠交配，成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。袁进等报道向通过向曲精細管内注射外源DNA，然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理，以使外源基因进入睾丸生精细胞然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一組的阳性检测率达25%。Sien 等则将处理方法更为简化，首先直接向雄兔睾丸内注射携帯绿色荧光表达的外源DNA及ニ 甲基亚枫的介质，使DNA能够进入睾丸細胞和生精細胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这ー转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法的结果。李碧春等以重组的緑色荧光蛋白基因为标记，首次在家鸡上通过采用公鸡睾丸内转染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和体外转染SSCs再移植的方法成功地生产出了转基因鸡，并且在家鸭和家鸡上转染功能基因进行验证，结果均说明该方法无需特殊的仪器要求，即可完成转染外源基因的过程，方法简单，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生产转基因鸡群，该方法的建立在家禽上意义重大，突破了制约家禽转基因生产的瓶颈，解决了家禽转基因难的问题，特别是体外转染移植的成功，不仅解决了家禽转基因难的问题，而且为成体干細胞的应用开辟了更广阔的应用前景。精子载体法中精子孵育前的预处理通常使精子的受精能力下降，于是许多学者尝试借鉴医学上的辅助生殖技术ICSI使处理精子受精，精子胞质内显微受精技术是借助显微操作仪将ー个精子或生精細胞直接注入卵母細胞质内，从而完成受精的过程。它降低了对精子各种指标的要求，使各种在体内外不可能发生正常受精的卵子受精，同时可以避免多精子受精，也为研究异种间受精提供了有效的途径1999年。美国科学家Perry等W4] 人首次将ICSI技术应用于动物转基因领域，成功地获得了转基因小鼠随即，研究者们分别在猕猴猪上也进行ICSI转基因的尝试，胚胎转基因阳性率也很高，然而这些实验最终并没有得到出生的转基因动物2006年，Kurom等把精子与携帯有人白蛋白(hALB)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列片断共孵化，通过ICSI方法生产的胚胎移植后生产出ー头含有hALB和GFP基因的转基因小猪Garc' a-Va' zquez等将猪的精子经不同方法处理，发现经冻融处理(frozen-thawing，FT)，不加冷冻保护剂速冻处理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)处理过的精子与新鲜的精子相比，它们结合外源DNA的能力明显增強，但其发育能力降低QF和ΤΧ-100处理精子所造成精子細胞膜的损伤与FT造成的损伤更能促进精子与外源DNA地结合实验还发现，用新鮮的精子与用FT和ΤΧ-100处理的精子经ICSI发育的胚胎中，EGFP表达的胚胎阳性率相近(分别为 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而经 QF 处理过的精子，EGFP 胚胎的阳性率明显提高(80. 43士5. 91%)。这表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起着至关重要的作用，经处理过的精子細胞膜更有利于外源DNA与精子染色体结合，但经QF和ΤΧ-100 处理，可能严重损伤精子的細胞核，引起DNA破碎，或导致染色体的破损，从而对胚胎将来的发育有害。胞浆内单精子注射仍需显微操作，但与原核注射相比技术难度降低很多。另外，对于ー些卵透明度不好的物种(如牛、羊、猪)，ICSI更能体现出技术上的优势；再有，精子注射针的尖端截面积约为显微注射针的100倍左右，对DNA没有任何剪切，尤其适合基因组 DNA, BAC或YAC库DNA大片段操作。同时ICSI法还具有受精率比较高，多精受精率低，排除透明带和卵质膜对精子入卵的阻碍作用、其受精率，不受精子浓度、形态和活力的影响等一系列优点。但通过该方法生产转基因动物，体外发育率低，仍许多问题有待解決。综上所述，现有转基因技术均存在成本高，投资大，技术要求高，操作复杂，转基因效率较低等缺点。所以，寻找ー种省吋，省力且效率较高的转基因方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的在精子载体法基础上建立起来的，通过对新鮮猪精子转染外源基因，进而获得携帯目的基因的精子，然后通过人工授精，得到转基因猪，根据本发明的技术方案， 选择特定的孵育时间，特定的浓度配比，能够大大提高转基因的效率。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案本发明一方面涉及ー种制备转基因猪精子的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将新鲜猪精液放置到16_18°C冰箱中平放保存，每7-9个小时轻轻翻转精子， 防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升磁性纳米液体材料和500-700微升的质粒载体，轻轻混勻，然后室温孵育，每15-25min轻轻翻转1_10次，孵育SO-IOOmin得到转基因猪斗B子。在本发明的ー个优选实施方式中，所述的质粒载体是pEGFP-Nl-pGH载体，报告基因为EGFP基因-增强型绿色荧光蛋白基因，目的基因为pGH基因-猪生长激素基因。在本发明的另外ー个优选实施方式中，所述的磁性纳米颗粒是产品名称 PolyMAG-1000, PEI修饰的氧化铁磁性纳米颗粒，货号9003，厂家为Chemicell。本发明另外一方面还涉及上述转基因猪精子在制备转基因猪中的用途，其特征在于将转基因猪精子通过人工授精的方法给予母猪，所述的人工授精方式优选是非外科手术方式的，例如注射等。在本发明的ー个优选实施方式中，其特征在于所述的转基因猪精子是新鲜制备的。本发明另外一方面还涉及制备转基因猪的方法，其包括上述转基因猪精子的制备步骤，其特征在于将携帯外源基因的猪精子通过人工授精的方法给予母猪，所述的人工授精方式优选是非外科手术方式的。在本发明的ー个优选实施方式中，上述制备转基因猪的用途和方法都是非治疗目的和/或非诊断目的的。本发明通过选择特定的孵育时间和浓度配比，相比于其它时间和浓度配比，能够显著的提高转基因的效率，达到45%左右。
具体实施例方式材料磁性纳米颗粒购于Chemicell、产品名称PolyMAG-1000，PEI修饰的氧化铁磁性纳米颗粒，货号9003 ；携带外源基因的载体质粒pEGFP-Nl-pGH载体，报告基因为EGFP 基因-增强型绿色荧光蛋白基因，目的基因为PGH基因-猪生长激素基因。步骤(1)购买新鮮猪精液两瓶，每瓶80毫升，有效精子数为30亿，每毫升为3. 75千万精子，然后将精子放置到17°C冰箱中平放保存，每8个小时轻轻翻转精子，防止精子沉淀；(2)每瓶精液里面加入600微升磁性纳米液体材料和600微升的质粒载体，轻轻混勻，然后放置在室温(25°C )孵育，每20min轻轻翻转几次。90min后人工授精至发情的母猪；(3) 114天妊娠后产仔，检测，转基因猪出生，待产仔后经检测其基因的表达情況， 检测绿色荧光蛋白基因的表达，其中在100头仔猪中有45头仔猪为阳性转基因猪，即带有外源绿色荧光蛋白基因的仔猪占所有仔猪的比例为45%左右。当理解的是，上述具体实施方式
仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.ー种制备转基因猪精子的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将新鲜猪精液放置到16-18°C冰箱中平放保存，每7-9个小时轻轻翻转精子，防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升聚乙烯亚胺(PEI)包裹的氧化铁磁性磁性纳米颗粒液体材料和500-700微升的浓度为500-800 μ g/ml质粒载体，轻轻混勻，然后室温孵育，每15-25min轻轻翻转1_10次，孵育SO-IOOmin得到转基因猪精子。
2.根据权利要求1所述的制备转基因猪精子的方法，所述的质粒载体是pEGFP-Nl-pGH 载体。
3.根据权利要求1或2所述的制备转基因猪精子的方法，所述的磁性纳米颗粒是 Chemicell 公司生产的 PolyMAG-1000。
4.权利要求1-3任意一项所述的方法制备的转基因猪精子在制备转基因猪中的用途， 其特征在于将转基因猪精子通过人工授精的方法给予母猪，所述的人工授精方式优选是非外科手术方式的。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于人工授精是通过注射来实现的。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的转基因猪精子是新鲜制备的。
7.根据权利要求4-6任意一项所述的用途，制备转基因猪的用途是非治疗目的和/或非诊断目的的。
8.ー种制备转基因猪的方法，其包括权利要求1-3任意ー项所述的转基因猪精子的制备方法，其特征在于将转基因猪精子通过人工授精的方法给予母猪，所述的人工授精方式优选是非外科手术方式的。
9.根据权利要求8所述的制备转基因猪的方法，其特征在于人工授精是通过注射来实现的。
10.根据权利要求8所述的制备转基因猪的方法，其特征在于所述的转基因猪精子是新鲜制备的。
全文摘要
本发明公开了一种制备转基因猪精子的方法，通过对新鲜猪精子转染外源基因，进而获得携带目的基因的转基因精子，然后通过人工授精，得到转基因猪。相比于其它方法，通过本发明的方法，选择特定的孵育时间和浓度比例，能够显著的提高转基因的效率。
文档编号C12N15/85GK102559751SQ20111038556
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者吴明明, 孙金海, 崔海信, 李奎 申请人:青岛农业大学