专利名称：用于pcr检测植物病害的内参基因的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种用于PCR检测出入境检验检疫植物病害中外源基因的内参基因的引物及其应用。属于生物工程技术领域。
背景技术：
随着经济全球一体化的逐步加深，世界各国及地区间经济关系密不可分，尤其是我国加入WTO后，国内外农产品贸易量的剧增，农作物检疫性有害生物入侵的速度和防控的难度都在不断加大，尤其是农业植物病害方面检疫，面临着巨大的挑战。由检疫性有害生物引起的灾害，其危害往往比气象灾害更为严重，防控不及就有可能造成严重损失。遵照 SPS协定科学性、风险管理、透明度、非歧视、等同性等原则，我国已相继对小麦、马铃薯、水果等市场解禁，大量疫麦、疫豆、高风险水果进入我国，加之对境外引种、边贸和走私等，以及在检疫上存在薄弱环节和系统检疫能力尚不够强大，致使疫情传入扩散的风险和疫情防御的难度越来越大，因此，植物病害检疫面临巨大挑战。截止2007年底，我国已发现检疫性有害生物46种，20世纪70年代发现1种，80 年代发现2种，90年代发现9种，近年新发现25种，仅2006年就新发现5种。每年因生物灾害造成的农作物产量损失在10%左右，经济损失达600多亿元。2007年3月，受起源于巴拿马的香蕉镰刀菌枯萎病的严重威胁，广东、海南、广西和福建香蕉产业遭到重创，2008 年四川省广元市旺苍县发生的柑橘大实蝇，在全国不少地方导致柑橘严重滞销，给果农造成严重经济损失。为了防止更为严重的外来疫害的威胁，国家对外来有害生物侵入以及造成的严重危害更加重视，相继出台了若干相关的法律法规，强化对有害生物的检疫检验工作，我国各出入境口岸及产地植物病害检疫检验迫切要求高效、特异、灵敏、快捷简便的诊断方法。因此，国家质检总局连续颁布了几十种农业植物病害PCR检测方法。比如SN/ T 1135. 4-2006马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法、SN/T 2071-2008亚洲柑桔黄龙病菌检疫鉴定方法、SN/T 1465-2004西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法、SN/T 1813-2006蝴蝶兰细菌性软腐病菌检疫鉴定方法、SN/T 1390-2004香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法、SN/T 2614-2010葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法等等。聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR技术)由于具有耗时短、特异强、灵敏高等特点，而成为目前植物病害检验检疫最广泛使用的技术之一。由于 PCR技术灵敏度高，容易出现假阳性、假阴性的检测结果，因此，在检测过程中，通常要设立多种的对照来监控操作PCR过程，包括内参DNA对照、阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照、PCR抑制对照、扩增试剂对照、提取空白对照、阳性提取对照、环境对照。从而排除PCR检测过程中可能出现的假阳性、假阴性结果。其中，内参DNA对照的设立是为了衡量模板DNA 质量，是否适合进行PCR检测，从而排除由模板中含有的杂质造成的假阴性检测结果(即阴性检测结果并不是因为样品中不含有外源DNA模板，而是因为DNA模板中存在抑制PCR扩增因子)的一个强有力依据。以现有报道，仅仅发现水稻的植物病害检测一般选择SPS基因为内参基因，大豆一般选择Lectin基因为内参基因，玉米的检测一般选择IVR基因或者ZSS IIb基因为内参基因，而其他植物病害检测内参基因未见报道。随着进出口植物种类的增多，一种植物病害检测对一种植物内参基因选择的方法越来越不切实际，不仅降低了工作效率而且增加检测的成本和检测的时间，这对检测任务重、工作量大检验检疫部门来讲更是增加了不少麻烦。因此，很有必要建立一个通用的植物内参基因检测引物，以满足多种多样进出口植物相关病害检测时内参基因需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于PCR检测植物病害的内参基因的引物，用于出入境植物寄生病害检测过程中PCR模板的评价。本发明的目的是这样实现的
本发明以NCBI公布的植物上叶绿体比较保守的功能基因核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶/ 加氧酶大亚基基因，根据已报道的30余种植物的rbcL基因序列表明，其编码区具有高度的保守性。下载已经克隆测序的rbcL基因序列，然后利用DNAMAN进行序列比对根据保守区设计定性PCR检测引物。1. 其特征在于所述定性PCR检测正向引物序列为 5，-TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA-3，，反向引物序列为 5，- ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG-3，。2.所述引物特异性的扩增rbcL基因的228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害检测过程中PCR模板的评价。与现有技术相比，本发明具有以下优点
1.本发明首次提出在植物病害定性PCR检测中建立通用的内参基因；
2.本发明首次提出将植物叶绿体的rbcL基因作为内参基因应用于植物病害定性PCR 检测；
3.本发明提出的检测引物，克服了针对一种植物一个内参基因的缺陷，大大的提高了检测效率、缩短了检测时间。
图1为rbcL基因特异性检测引物溶解曲线分析；A为rbcL_l引物溶解曲线；B为 rbcL-2引物溶解曲线；
图2为rbcL-Ι引物退火温度的优化；M为分子标量100 bp DNA Ladder Marker，泳道 1-10 分别代表退火温度为48. 80C>49. 90C>51. 30C>52. 80C>54. 50C>56. 1°C>57. 7"C、 59. O0C >59. 90C >60. 5°C，泳道 11 为空白对照；
图3为30种不同植物内参基因rbcL特异性扩增电泳图；M为分子标量IOObp DNA Ladder,泳道1_30为植物样品材料编号；
图4为引物rbcL-1 PCR扩增灵敏度电泳图；M为分子标量IOObp DNA Ladder,泳道 1 2，3 4，5 6，7 8，9 10，11 12，13 14，15 16，17 18，19 20，分别为 20ng/yL、 lOng/μ L,5ng/y LUng/μ L,500fg/y LUOOfg/μ L,50fg/y LUOfg/μ L,5fg/y LUfg/ μ L0
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1 rbcL基因特异性PCR检测引物溶解曲线分析 1实验材料
1.1植物材料 DNA,由福建农林大学甘蔗综合研究所提供。1.2酶及试剂
Power SYBR Green PCR Master Mix 为 ABI 公司产品；RNase A购自 TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司；引物合成和克隆测序有南京金斯瑞生物科技有限公司完成；其余生化试剂均为国产分析纯。主要仪器
定量PCR仪美国ABI公司生产7500型；离心机德国Eppendorf 5810型；PCR仪德国 Eppendorf 公司 Master Cycler gradient 96 ；核酸蛋白分析仪瑞典 APBiotech 产品； 生物安全柜上海力新有限公司。2实验方法和过程
2. 1 DNA提取与PCR引物 DNA提取按照国家标准GB/T 19495. 3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法。引物由南京金丝瑞生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和扩增产物长度表1。表1引物序列与产物大小
权利要求
1.一种用于PCR检测植物病害的内参基因的引物，其特征在于所述内参基因为rbcL 基因，所述引物为正向引物序列为5’ TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA 3’，反向引物序列为5’ ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG 3’。
2.根据权利要求1所述引物的应用，其特征在于所述引物特异性的扩增rbcL基因的 228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害检测过程中PCR模板的评价。
全文摘要
本发明提供了一种用于PCR检测植物病害的内参基因的引物及其应用，属于生物工程技术领域。所述内参基因为rbcL基因，所述引物为正向5’TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA3’，反向5’ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG3’，所述引物特异性的扩增rbcL基因的228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害检测过程中PCR模板的评价。本发明首次提出在植物病害定性PCR检测中建立通用的内参基因；首次提出将植物叶绿体的rbcL基因作为内参基因应用于植物病害定性PCR检测；本发明提出的检测引物，克服了针对一种植物一个内参基因的缺陷，大大的提高了检测效率、缩短了检测时间。
文档编号C12N15/11GK102367485SQ20111038801
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者王恒波, 许莉萍, 郭晋隆, 陈如凯, 陈平华, 黄国强 申请人:福建农林大学