专利名称：用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法
用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种候选药物的高内涵筛选方法，尤其涉及以心脏转基因斑马鱼为模型，筛选促进心肌细胞形成的药物前体(小分子化合物)的方法。
背景技术：
心血管疾病是危害人类健康的最常见疾病，其发病率和死亡率已经超过恶性肿瘤位居第一位。尽管现代医学不断取得进步，但对心肌梗死和心力衰竭等缺血性心脏病的治疗仍然面临巨大挑战，发展能够在心肌梗死区激发心肌细胞形成和再生以增加心肌细胞数量的治疗方法，在临床上具有巨大的医疗前景和经济效益。发现新的能够诱导外源或内源的成年心脏干细胞分化成心肌细胞的生物试剂和小分子物质对于心脏的损伤修复有治疗意义。因此建立一种有效的筛选促进心肌细胞形成的小分子化合物的方法具有重要意义。
斑马鱼是一种非常好的模式生物，斑马鱼全身透明的特性有助于观察其表型的改变，是国内外研究药物的有效工具。建立带有绿色或者红色荧光的转基因斑马鱼品系，易于观察不同化合物对其表型的影响。成体斑马鱼长3-4厘米，一次交配能够获得100-200枚胚胎，每周产卵一次，其喂养和维持的费用较低，所需空间场地不大，适于室内大规模繁殖。 目前，斑马鱼主要用于遗传发育方面，利用其作为研究对象筛选能够促进心肌细胞形成的小分子化合物的方法还没有相关报道。发明内容
本发明目的是提供一种操作方便，成本低，实验结果可靠准确，快速筛选诱导心肌细胞形成的小分子化合物的方法。
本发明提供的筛选诱导心肌细胞形成的小分子化合物的方法，采用模式生物转基因斑马鱼，具体步骤如下1、对从药物库中取出的各种不同结构的小分子化合物，用DMSO (二甲亚砜)作为助溶剂，配成ImM的储存液；在表型筛选时，将每种化合物用胚胎培养液稀释成1_30μΜ。
2、使心脏转基因斑马鱼Tg(CmlC2:EGFP)纯合体进行交配，获得胚胎，培养至50% 外包期(受精后5小时)；然后将胚胎转移至培养板(如96孔板)中，每孔置入适量胚胎(如 3枚胚胎)，同时加入不同小分子化合物的胚胎培养液，在20-30°C胚胎培养箱进行培养；其中，DMSO作为空白对照组；在胚胎发育不同阶段(例如培养至M小时，48小时，72小时等不同阶段)，对胚胎心脏大小和心脏形态进行仔细的检查，并且通过细胞核标记的转基因斑马 iTg(CmlC2:DSRed-nUC)进行心肌细胞计数；最后对实验结果进行初步判定，分析各个小分子化合物对心肌细胞形成的影响。
3、检查胚胎的整体形态(比如背腹体轴和前后体轴等)及其它器官(包括大脑，眼睛，脊索和体节等)是否受到影响；通过观察结果分析判定各个小分子化合物是否对胚胎其它器官有毒性作用。
根据上述两个筛选标准，能够获得促进心肌细胞形成的药物分子，而这些药物分子对胚胎和其它器官则没有毒性作用或者毒性较小；本发明提供的用模式生物斑马鱼筛选促进心肌细胞形成的小分子化合物的新方法和现有技术比较有以下优点可操作性强，实验准确性高，化合物初筛的成功率高，同时活体内观察，化合物组织特异性强，可直接观察化合物的毒副作用，提高候选药物筛选的效率。
图1为体内筛选鉴定影响心脏发育的小分子化合物筛选过程示意图。
图2为心肌小分子化合物对心脏形成的影响。其中，A为心肌小分子化合物对心肌细胞的数量的影响；B心肌小分子化合物对不同发育时期心肌细胞形成发育影响的示意图；C为心肌小分子化合物对不同发育时期心肌细胞数量的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施所描述的具体的化合物的来源，浓度，斑马鱼的选择及其结果仅适用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
1.选择合适的化合物库或合成新的化合物本实例化合物的来源，从美国范德比特大学(Vanderbilt University)化学生物所的高通量药物筛选库中获取4000个不同结构的化合物，用DMSO将每种小分子化合物均配制成ImM的储存液。
2.选择观察目的相关的转基因斑马鱼品系本实例目的是观察促进心肌细胞形成的小分子化合物，因此选择带有心肌标记基因的斑马鱼Tg(cmlc2:EGFP)品系(国际斑马鱼资源中心可购买)和Tg(cmlc2:DsRed-nuc)品系 (国际斑马鱼资源中心可购买)。
3.不同化合物浓度的选择，选择最佳浓度化合物本实例化合物库中所选择的浓度是ΙΟμΜ，因此在化合物处理胚胎前，先将每种化合物用胚胎培养液稀释100倍成为ΙΟμΜ。
4.鱼卵的选择将用心脏标记的转基因斑马鱼Tg(CmlC2:EGFP)纯合体进行交配获得胚胎，培养至50% 外包期(受精后5小时)。
5.化合物的处理过程将50%外包期(受精后5小时)的胚胎转移至96孔板中，每孔中置入3枚胚胎，同时加入不同小分子化合物的胚胎培养液，在观.5°C胚胎培养箱进行培养，其中DMSO作为空白对照组。具体过程如示意图1。
6.观察胚胎分别发育至M小时，48小时，72小时对胚胎心脏大小，心脏形态及心脏收缩性进行仔细的检查，并且通过细胞核标记的转基因斑马鱼Tg(CmlC2:DSRed-nuC)进行心肌细胞计数(图2)。此外，还仔细检查了胚胎的整体形态(比如背腹体轴和前后体轴等)及其它器官，包括大脑，眼睛，脊索和体节等是否受到影响。最后通过这些观察结果来初步判定小分子化合物是否特异性的诱导心肌细胞的形成，以及这些小分子化合物是否对胚胎及其它器官有毒性作用。
以上所述仅是本发明的一个实例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如化合物对其它脏器表型的影响等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范畴。
权利要求
1. 一种用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法，其特征在于，具体步骤为(1)、对从药物库中取出的各种不同结构的小分子化合物，用二甲亚砜作为助溶剂，配成IrnM的储存液；在表型筛选时，将每种化合物用胚胎培养液稀释成1-30μΜ ；(2)、使心脏转基因斑马鱼Tg(CmlC2:EGFP)纯合体进行交配，获得胚胎，培养至50%外包期；然后将胚胎转移至培养板中，每孔置入适量胚胎，同时加入不同小分子化合物的胚胎培养液，在20-30°C胚胎培养箱进行培养；其中，二甲亚砜作为空白对照组；在胚胎发育的不同阶段，对胚胎心脏大小和心脏形态进行仔细的检查，并且通过细胞核标记的转基因斑马iTg(CmlC2:DSRed-nUC)进行心肌细胞计数；最后对实验结果进行初步判定，分析各个小分子化合物对心肌细胞形成的影响；(3)、检查胚胎的整体形态，及其它器官包括大脑，眼睛，脊索和体节等是否受到影响； 通过观察结果分析判定各个小分子化合物是否对胚胎其它器官有毒性作用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体为用模式生物斑马鱼筛选诱导心肌细胞形成的药物的方法。本发明首先将25-30对Tg(cmlc2:EGFP)转基因斑马鱼纯合体进行交配获得胚胎，然后将胚胎转移到培养板中，每孔中加入适量已发育至50%外包期的斑马鱼胚胎，用含有1-30μM小分子化合物的胚胎培养液放置于培养箱进行培养；然后对胚胎心脏大小、心脏形态和心肌细胞数目进行仔细检查；此外，还检查胚胎的整体形态(比如背腹体轴和前后体轴等)及其它器官形成是否受到影响。最后通过这些实验结果来初步判定这些小分子化合物是否促进心肌细胞的形成而不影响其它器官的发育。通过这种方法所筛选出来的新药特异性强，毒副作用低。
文档编号C12Q1/02GK102520130SQ201110403099
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者钟涛 申请人:复旦大学