专利名称：利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产单细胞油的方法，尤其涉及一种利用玉米芯木糖渣水解液 (糖化液)培养隐球酵母(Cryptococcus curvatus)发酵生产单细胞油的方法。
背景技术：
单细胞油脂，又称微生物油脂，是微生物或藻类以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂，其中有些油脂具有高附加值。其脂肪酸组成与植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸为主，如棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸 (C18:l)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)等。微生物油脂可以广泛应用于食品、医药、精细化工等行业。目前，国内外工业用油和食用油脂主要来源于动、植物和化石资源，随着可耕用土地的日益减少和化石资源的逐渐枯竭以及生物技术的进步，工业用油势必走向多种渠道开发的途径。单细胞油脂作为一种新型油脂已经引起人们的广泛关注。近年来，关于利用蔗糖、糖蜜、乳糖、工业废液及木质纤维素来生产微生物油脂已经有所报道。刘宏娟等利用两步水解木质纤维素所得水解液和两次补料发酵得到单细胞油，赵宗保等也利用玉米秸秆的无机酸或纤维素酶水解液进行单细胞油的生产。但上述实验所需水解液的获得需要大量的稀酸等化学试剂，带来环境问题的同时极大地增加了生产成本。玉米芯经酸水解，利用其中的半纤维素制取木糖醇及低聚木糖等高附加值产品后，废弃的纤维素残渣即是木糖渣，脱木素木糖渣为木糖渣经碱处理脱除木素后的残渣，均为生物炼制过程中产生的废渣。经检索，利用木糖渣和脱木素木糖渣水解液培养产油微生物，生产单细胞油的研究还未有报道，因而利用木糖渣及脱木素木糖渣发酵生产单细胞油的方法具有极其重要的实际意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用玉米芯木糖渣水解液 (糖化液)培养隐球酵母(Cryptococcus curvatus)发酵生产单细胞油的方法。本发明所述利用生物质资源水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法的步骤是(1)糖化液制备取玉米芯木糖渣，以15 35个滤纸酶活单位(FPA)每克干木质纤维素的量添加纤维素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴30 60min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于7000 IOOOOrpm下离心6 lOmin， 得澄清的糖化液；其中上述玉米芯木糖渣是指脱木素木糖渣或木糖渣；(2)糖化液的脱毒处理将上述糖化液水浴加热至80°C，再加入其质量百分比为 0. 6 1. 2%的活性炭，搅拌30 50min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；
(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以体积百分比为4 10%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30士2°C、200士50rpm，摇床震荡培养 60 80h，得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提将步骤(3)的发酵液于7000 9000rpm下离心8 15min 收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 4次；以酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油。上述步骤(1)所述的纤维素酶酶液是商品纤维素酶或是任何能产生纤维素酶的菌种所产生的纤维素酶。商品纤维素酶可以是液体酶，也可以是固体酶粉。纤维素酶的制备方法是纤维素酶产生菌(例如青霉属、木霉属或曲霉属菌株)按常规量接种于纤维素酶产酶培养基中，在观 30°C，摇床转速200 300rpm下，产酶发酵96 120小时，然后将所有发酵物在5000 lOOOOr/min的转速下离心15 40min，收集上清液即获得纤维素酶粗酶液。上述步骤(1)所述纤维素酶添加量优选20 30个滤纸酶活单位每克干木质纤维素，糖化温度优选40 50°C，糖化时间优选70 80h。上述步骤⑵所述活性炭的质量百分比优选为0. 8 1. 0%，搅拌时间优选30 35min。上述步骤( 所述隐球酵母的培养条件优选是30°C、200rpm摇床震荡培养65 75h。上述步骤(4)所述发酵液优选于8000rpm下离心IOmin收集菌体。本发明提供一种利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，较现有技术中利用玉米秸秆的无机酸或纤维素酶水解液进行单细胞油生产的方法，具有工艺简便、成本较低、无污染、油脂产量高的特点。显著克服了上述实验所需水解液的获得需要大量的稀酸等化学试剂带来的环境污染问题，同时极大地降低了生产成本。本发明方法中利用的生物质资源具有原料丰富、价格低廉、加工方便的优势，可显著降低单细胞油的生产成本，更重要的是生物质资源的充分利用，处理了农业废料，对改善我国能源紧缺状况，保障我国能源可持续供给，缓解能源危机具有重要的实际意义和重要的经济价值。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。实施例1(1)纤维素酶液的制备将斜卧青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO以常规量接种于产酶培养基中，300C，250rpm下震荡培养产酶，6000rpm下离心30min，收集上清液即为纤维素酶粗酶液；上述产酶培养基配方为20g/l木糖渣，30g/l麸皮，6g/l微晶纤维素，5g/l豆饼粉，2g/l硫酸铵，lg/Ι尿素，2g/l硝酸钠，3g/l磷酸二氢钾，0. 5g/l硫酸镁，3ml/l吐温80 ；(2)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加纤维素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(4)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h，得含单细胞油的发酵液；(5)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次；酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；实验结果斜卧青霉粗酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖的浓度达到了 49g/l，在未经脱毒处理的产油糖化液培养基中的隐球酵母的菌体干重达到了 15. OOg/Ι，单细胞油达到了 6. 14g/l，油脂含量为40. 92%。在脱毒后产油糖化液培养基中，隐球酵母菌体干重和单细胞油分别达到了 15. 16g/l和6. 18g/l，油脂含量为40. 73%。实施例2(1)纤维素酶液的制备将斜卧青霉以常规量接种于产酶培养基中，30°C，250rpm 下震荡培养84h产酶，6000rpm下离心30min，收集上清液即为纤维素酶粗酶液；上述产酶培养基配方为20g/l木糖渣，30g/l麸皮，6g/l微晶纤维素，5g/l豆饼粉，2g/l硫酸铵，lg/Ι尿素，2g/l硝酸钠，3g/l磷酸二氢钾，0. 5g/l硫酸镁，3ml/l吐温80 ；(2)糖化液制备取脱木素木糖渣，以30个FPA每克干底物添加纤维素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(4)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以8%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养75h，得含单细胞油的发酵液；(5)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次；酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；实验结果斜卧青霉粗酶液酶解脱木素木糖渣所得的糖化水解液的葡萄糖的浓度达到了 52g/l.经过80h的培养，隐球酵母在产油糖化液培养基中的菌体干重达到了 16. 30g/l，油脂含量为42. 92%，单细胞油产量达到了 7. 00g/l。
实施例3(1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于青岛康地恩生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以8%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h，得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油； 实验结果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液中，康地恩酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖浓度达到了 Mg/Ι。用于隐球酵母的培养时，隐球酵母的菌体干重达到了 23. 43g/ 1，油脂含量达到了 46. 74 %，单细胞油产量达到了 10. 95g/l。实施例4(1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以20个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于青岛康地恩生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养65h，得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；实验结果在pH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液中，康地恩纤维素酶酶解脱木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的浓度达到了 56g/l。用于隐球酵母的培养时，隐球酵母的菌体干重达到了 17. 36g/l，油脂含量达到了 44. 35%，单细胞油产量达到了 7. 70g/l。实施例5 (1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于杰能科生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液在
645°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h，得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；实验结果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液中，杰能科酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖浓度达到了 52g/l。用于隐球酵母的培养时，隐球酵母的菌体干重达到了 15. 31g/ 1，油脂含量达到了 40. 21%，单细胞油产量达到了 6. 16g/l。实施例6(1)糖化液制备取木糖渣，以20个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于杰能科生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液在50°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以7%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养65h，得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g 湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；实验结果在pH4. 8的H2O缓冲液中，杰能科酶液酶解脱木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的浓度达到了 51g/l。用于隐球酵母的培养时，隐球酵母的菌体干重达到了 17. 86g/ 1，油脂含量达到T 37. 35 %，单细胞油产量达到T 6. 67g/l。
权利要求
1.一种利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，步骤是(1)糖化液制备取玉米芯木糖渣，以15 35个滤纸酶活单位(FPA)每克干木质纤维素的量添加纤维素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴 30 60min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于7000 IOOOOrpm下离心6 lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将上述糖化液水浴加热至80°C，再加入其质量百分比为0.6 1. 2%的活性炭，搅拌30 50min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液发酵隐球酵母以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以体积百分比为4 10%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30士2°C、200士50rpm，摇床震荡培养60 80h， 得含单细胞油的发酵液；(4)单细胞油粗提将步骤(3)的发酵液于7000 9000rpm下离心8 15min收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 4次；以酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml 的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油。
2.如权利要求1所述利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，其特征在于步骤(1)所述纤维素酶添加量为20 30个滤纸酶活单位每克干木质纤维素，糖化温度为40 50°C，糖化时间为70 80h。
3.如权利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，其特征在于步骤(2)所述活性炭的质量百分比为0. 8 1. 0%，搅拌时间为30 35min。
4.如权利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，其特征在于步骤(3)所述隐球酵母的培养条件是30°C、200rpm摇床震荡培养65 75h。
5.如权利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，其特征在于步骤(4)所述发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体。
全文摘要
本发明公开了一种利用玉米芯木糖渣水解液培养隐球酵母生产单细胞油的方法，较现有技术中利用玉米秸秆的无机酸或纤维素酶水解液进行单细胞油生产的方法，具有工艺简便、成本较低、无污染、油脂产量高的特点；显著克服了上述实验所需水解液的获得需要大量的稀酸等化学试剂带来的环境污染问题，同时极大地降低了生产成本。本发明对生物质资源的大量利用，处理了农业废料，对改善我国能源紧缺状况，保障我国能源可持续供给，缓解能源危机具有重要的实际意义和重要的经济价值。
文档编号C12P7/64GK102392058SQ201110403848
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者宋欣, 马晓静 申请人:山东大学