专利名称：β-1,4-内切葡聚糖酶(TviCel5A)基因的克隆及表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的一种β _1，4_内切葡聚糖酶基因cDNA序列的克隆及表达，属于生物工程技术领域。
背景技术：
纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系，纤维素酶是由外切葡聚糖酶 (exo-cellobiohydrolases, CBH)、内切葡聚糖酶(endoglucanases, EG)以及 β -葡聚糖苷酶(i3-glUCOsidases，BG)组成复合酶系。其中内切葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分， 它首先作用于纤维素，随机水解纤维素分子内部的糖苷键，将纤维素链打断，它对整个纤维素的降解过程中起关键的作用。绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和康宁木霉(Trichoderma koningii)等是近年来研究较多的产纤维素酶丝状真菌。木霉所产的纤维素酶系统包括5种内切葡聚糖酶，即EG I,EG II、EGIII、EGIV和EGV， 而EG II是主要作用成分。随着纤维素酶的广泛应用，关于纤维素酶的研究也越来越多，目前人们已经从20多种细菌和数种真菌中克隆得到百余个纤维素酶的基因，其中一些酶的基因核苷酸序列已被测定并在大肠杆菌和酵母中得到了表达。基因的克隆既可以直接用于研究酶的结构与功能，也可为酶的合成调控与降解机制研究提供了工具与手段。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展起来的真核表达系统，其不仅具有大肠杆菌繁殖快、易于培养、遗传操作简单和易于工业化生产等原核生物的特点，还具有真核生物基因表达调控和蛋白修饰功能，如糖基化、蛋白磷酸化等，避免了产物形成包涵体，活性降低等问题。基于以上原因，毕赤酵母是表达木霉内切葡聚糖酶较好的系统之
发明内容
本发明的目的是提供一种T. VirideWL 0422菌株β-1，4_内切葡聚糖酶基因cDNA 序列克隆，β-内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化方法。生物信息学分析表明，来源于Τ. viride Wi)422菌株的β-内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Tvi Cel5A，其相应的基因命名为Tvi cel5A。Tvi Cel5A具有较高的催化活性和热稳定性，具有较大的研究和应用潜力。T. viride WL 0422菌株由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2006年在《江苏食品与发酵》杂志的No. 1 Pg. 1公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。本发明的技术方案一种来源于T. VirideffL 0422的第5家族葡聚糖酶基因(Tvi cel5A)，其 cDNA 序列为 SEQ ID NO :1。所述的由完整cDNA推导的Tvi Cel5A氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的重组Tvi Cel5A的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 5. 0、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5%的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入 0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应15min，立即各加入2. 5mL 3'，5' —二硝基水杨酸 (DNS)试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL， 摇勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖(以葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个β -1,4-内切葡聚糖酶活性单位(U)。所述的Tvi Cel5A成熟肽基因的克隆和表达方法(I)Tvi Cel5A cDNA序列的克隆基于绿色木霉Tvi Cel5A成熟肽基因cDNA序列设计两条引物PPIC9KN和pPIC9KC，扩增成熟肽基因pPIC9KN 5' -CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点pPIC9KC 5' -CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3 ‘，含 Not I 酶切位点按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)说明书进行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和pPIC9KN为引物进行第一轮PCR;以pPIC9KN和pPIC9KC为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，并割胶回收目的条带。(2)含编码Tvi Cel5A成熟肽基因的表达质粒的构建使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Tvi cel5A(图1)， 并对重组表达质粒进行序列测定。(3)GS115/Tvi cel5A重组子的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对 pPIC9K-Tvi cel5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Tvi cel5A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组葡聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组β_1，4-内切葡聚糖酶。本发明的有益效果本发明的目的是提供一种Τ. viride WL 0422菌株β-I，4_内切葡聚糖酶基因cDNA序列克隆，β -内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β -内切葡聚糖酶的高效表达和纯化方法。生物信息学分析表明，来源于Τ. virideWL 0422菌株的β -内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Tvi Cel5A，其相应的基因命名为Tvi cel5A。 TviCel5A具有较好的pH稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值，也为其它葡聚糖酶的研究奠定了基础。
图1 重组质粒pPIC9K_Tvi cel5A示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1 Tvicel5A cDNA序列的克隆以01 igo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以
4M13 Primer M4和pPIC9KN为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C anin，30个循环 (94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s)，72°C IOmin ；以 pPIC9KN和 pPIC9KC 为引物进行第二轮 PCR， 其反应条件为94 °C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s), 72 °C IOmin0 将两轮 PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，并割胶回收目的条带。实施例5含编码TviCel5A成熟肽基因的表达质粒的构建使用EcoR I和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，酶切时间为4h，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下连接过夜(> 1 1)，得到重组质粒 pPIC9K-Tvi cel5A(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。实施例6 GS115/Tvi cel5A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K_Tvi cel5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、 筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Tvi cel5A。该工程菌用5.0%甲醇诱导120h， DNS法测得发酵液中重组葡聚糖酶活性达2788IU/mL。离心上清液为重组葡聚糖酶粗酶液， 经截留分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-kpharose Fast Flow离子交换层析和kphadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组葡聚糖酶分子量为42kDa。该重组葡聚糖酶最适作用温度50°C，最适作用pH 4.5，该酶在？!1 3. 5 6. 0、55°C以下稳定。 权利要求
1.一种来源于T. VirideWL 0422的第5家族内切葡聚糖酶基因(Tvi cel5A)，其mRNA 序列对应于序列表中的SEQ ID NO :1ο
2.由权利要求1所述的β-1，4-内切葡聚糖酶基因(Tvicel5A)编码的β_1，4_内切葡聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。
3.绿色木霉札0422Tvi Cel5A成熟肽cDNA序列的获取方法基于绿色木霉Tvi Cel5A成熟肽基因cDNA序列设计两条引物pPIC9KN和pPIC9KC，扩增成熟肽基因PPIC9KN 5' -CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3'，含 EcoR I 酶切位点PPIC9KC 5' -CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3 ‘，含 Not I 酶切位点按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)说明书进行RT-PCR ；以 Oligo dT-Adaptor Primer 为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和pPIC9KN为引物进行第一轮 PCR ；以pPIC9KN和pPIC9KC为引物进行第二轮PCR ；将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，并割胶回收目的条带。
4.含编码TviCel5A成熟肽基因的表达质粒的构建和表达方法(1)使用EcoRI和Not I对割胶回收的目的基因与pPIC9K分别进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Tvi cel5A(图1)， 并对重组表达质粒进行序列测定；(2)用MlI对pPIC9K-Tvi cel5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Tvi cel5A;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组葡聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，获得了电泳纯的重组β_1，4-内切葡聚糖酶。
全文摘要
本发明提出了一种源自T.virideWL 0422菌株β-1，4-内切葡聚糖酶基因cDNA序列克隆，β-内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO1。生物信息学分析表明，来源于T.virideWL 0422菌株的β-内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Tvi Cel5A，其氨基酸序列为SEQ ID NO2，其相应的基因命名为Tvi cel5A。Tvi Cel5A具有较高的催化活性和热稳定性，具有较大的研究和应用潜力。
文档编号C12N15/56GK102392034SQ20111041045
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者汪俊卿, 罗秋玲, 邬敏辰, 陈忠法, 龚燕燕 申请人:江南大学