专利名称：一种Taqman水解探针以及定量检测MGMT甲基化程度的方法
技术领域：
本发明涉及一种Taqman水解探针和一种检测MGMT甲基化程度的方法。
背景技术：
人类MGMT基因定位于染色体10q26，全长大约1701Λ，由5个外显子以及4个内含子构成。MGMT蛋白在不需要任何辅助因子或其它蛋白质的条件下，可以催化DNA分子中的鸟嘌呤O6位上的烷基转移到MGMT本身第145位的半胱氨酸残基上，鸟嘌呤得以复原，DNA 的结构和功能得以恢复，从而保护细胞免受烷化剂的损伤。含甲基和氯乙基抗癌药物的细胞毒作用主要是有赖于它与DNA之间形成烷基，引起链内交联的能力。而MGMT可将烷基从烷基化的DNA链中移除，致烷化剂治疗无效。所以MGMT在正常组织中可消除烷化剂对细胞的致癌作用；在肿瘤细胞中却能消除烷化类药物的细胞毒作用。肿瘤细胞对含甲基和氯乙基的抗癌药物耐药常与高水平的DNA修复蛋白MGMT有关，O6烷基鸟嘌呤修复程度依赖于细胞内MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度，因此检测MGMT启动子区域的甲基化程度就有着重要的意义。目前检测MGMT启动子区域甲基化的方法主要有1、甲基化敏感性内切酶；2、亚硫酸氢盐的修饰；3、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白；4、质谱或色谱等精密检测手段。由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA 序列。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是相对简单，成本低廉，甲基化位点明确， 实验结果易解释；缺点是a、由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；b、只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义； c、相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；d、存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；d、不适用于混合样本。亚硫酸氢盐的修饰法是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法。NaHS03可将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T =A配对， 但甲基化的C则能抵抗NaHS03的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP测序、PCR(COBRA、MSP、Methelight 等)、芯片杂交技术(microarray)，此类方法适应于检测已知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG位点的甲基化，属位点特异性DNA甲基化检测技术。其中MSP方法是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法，可检出比例为千分之一的甲基化片段。可靠的MSP，关键在于引物，其引物设计需两个已知的、包含多个完全甲基化或非甲基化CpG位点的区域，但具有上述区域的CpG岛并不多，限制了 MSP的使用。
发明内容
为了克服上述背景技术存在的缺陷，本发明针对人类MGMT基因启动子区154 172DNA序列，提供了一种Taqman荧光水解探针，还提供了一种利用该Taqman水解探针定量
3检测MGMT甲基化程度的方法。本发明的技术方案如下该Taqman荧光水解探针的基本序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列与基 因组DNA序列互补区向上游延伸不超过5nt，下游延伸不超过5nt。ー种利用上述Taqman荧光水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法，包括以下 步骤(1)制备PCR反应模板用亚硫酸氢盐对样品基因组DNA进行甲基化转化处理；(2)配置反应体系向一支PCR反应管中依次加入下列组份10 X PCR 缓冲液 2ul ；四种dNTP (三磷酸脱氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上游引物 10 IOOpmol;甲基化下游引物 10 IOOpmol;亚硫酸盐处理后模板DNA 25 50ng;热启动DNA聚合酶2.5u;加双蒸水至20ul;向另ー支反应管中依次加入下列组份10 X PCR 缓冲液 2ul ；四种dNTP (三磷酸脱氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上游引物 10 IOOpmol;非甲基化下游引物 10 IOOpmol;亚硫酸盐处理后模板DNA 25 50ng;热启动DNA聚合酶2. 5u ；加双蒸水至20ul ；(3)将反应体系置于荧光PCR反应仪中，按照以下程序进行反应；PCR反应程序95 "C IOmin ；
权利要求
1.一种Taqman荧光水解探针，其特征在于该Taqman荧光水解探针的基本序列为 GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列与基因组DNA序列互补区向上游延伸不超过5nt，下游延伸不超过5nt。
2.一种利用如权利要求1所述的Taqman荧光水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法，包括以下步骤(1)制备PCR反应模板用亚硫酸氢盐对样品基因组DNA进行甲基化转化处理；(2)配置反应体系向一支PCR反应管中依次加入下列组份 10 X PCR 缓冲液 2ul ；四种dNTP (三磷酸脱氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上游引物 10 IOOpmol ；甲基化下游引物 10 IOOpmol ；亚硫酸盐处理后模板DNA 25 50ng ；热启动DNA聚合酶2. 5u;加双蒸水至20ul ；向另一支PCR反应管中依次加入下列组份 10 X PCR 缓冲液 2ul ；四种dNTP (三磷酸脱氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上游引物 10 IOOpmol ；非甲基化下游引物 10 IOOpmol ；亚硫酸盐处理后模板DNA 25 50ng ；热启动DNA聚合酶2. 5u;加双蒸水至20ul ；(3)将反应体系置于荧光PCR反应仪中，按照以下程序进行反应； PCR反应程序·95 0C IOmin ；·95 0C45sec;>·57 0C45sec；> 40 cycle·72 0C30secr·72 0C 2min ；(4)通过荧光PCR仪配套软件获取分别对应于两支PCR反应管的甲基化反应的Ct值和非甲基化反应的Ct值；(5)按照以下计算式甲基化百分含量=100/[1+2 (CtCG-CTTG) ] % 计算得到MGMT甲基化程度。
全文摘要
本发明提供了一种Taqman荧光水解探针以及利用该Taqman水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法。该Taqman荧光水解探针的基本序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列与基因组DNA序列互补区向上游延伸不超过5nt，下游延伸不超过5nt。本发明双重保证了PCR的特异性；可定量计算出混合样本中甲基化DNA模板的百分含量；具备实时定量PCR的所有优势，如快速，灵敏，无污染等。应用本发明的检测结果可对脑胶质瘤等恶性肿瘤的化疗用药提供临床指导，具有高特异性，高灵敏度和准确定量等优势。
文档编号C12N15/11GK102424857SQ201110455660
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘端, 周慧敏, 戴鹏高, 王浩, 陈超 申请人:陕西北美基因股份有限公司