专利名称：脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用。
背景技术：
由任意序列寡脱氧核苷酸组成的寡脱氧核苷酸文库(oligonucleotidelibraries)已被广泛地应用于测序、突变体诊断、基因表达和微生物鉴定。但是，寡脱氧核苷酸文库的应用中有一个明显的不足之处，就是随着寡脱氧核苷酸链上碱基数的增加，文库按4倍比率(4N，N为寡脱氧核苷酸链上碱基数)迅速变大，如8个碱基长的寡脱氧核苷酸全文库就包含65536(48)种寡脱氧核苷酸链，从而导致①难合成，尤其是长链寡脱氧核苷酸文库；②成本很高。为此，研究人员通过缩短寡脱氧核苷酸链长度来减小文库。但是，人们发现这样做有一些缺点，如杂交稳定性差、难区分末端错配等。有研究发现，既能减小文库又能克服以上这些缺点的一种比较有效的方法是在寡核苷酸链上加入通用碱基(universal base)，因通用碱基均能同4种常见碱基(鸟嘌呤即G、腺嘌呤即A、尿嘧啶即U和胞嘧啶即C)进行碱基配对，所以可以在不缩短寡脱氧核苷酸链的前提下，减小寡脱氧核苷酸文库。除鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C) 4种自然碱基外，次黄嘌呤(I)被发现存在于一些tRNAs的反义密码子(anticode)的第三位碱基的摆动性位置(wobbleposition)上，能够与mRNAs密码子上的腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶进行碱基互补配对。脱氧次黄嘌呤已作为通用碱基被成功加入到引物中用于PCR反应的DNA扩增及测序。还有报道说在PCR扩增反应时，当三种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度正常而第四种三磷酸脱氧核糖核苷酸浓度比较低时，三磷酸脱氧次黄嘌呤核苷酸能够被聚合酶所识别而纳入到PCR产物中去。但是，到目前为止，通用碱基加入到寡脱氧核苷酸链而进行连接反应的相关研究工作还很少。已有研究发现当其他通用碱基3-硝基吡咯和5-硝基吡咯处在寡脱氧核苷酸链的5’ -末端或3’ -末端时，它们不能被T4DNA连接酶所识别。Luo等研究发现，当通用碱基3-硝基吡咯处于3’ -末端附近时(仍然处于连接酶的活性位置)，它能够被Tth DNA连接酶所识别，并能提高连接反应的保真度。除了硝基吡咯，还没有对通用碱基脱氧次黄嘌呤在连接反应中的应用进行过研究和报道。而且，有别于硝基吡咯的很难被掺入到寡脱氧核苷酸链中，通用碱基脱氧次黄嘌呤很容易被掺入合成到寡脱氧核苷酸链中，现已有国内外多家公司能提供这方面的服务和技术支持，如美国的htegrated DNA Technologies(IDT),国内的生工生物工程(上海)有限公司等，这为将脱氧次黄嘌呤作为通用碱基应用到连接反应提供了极大的可能性。本发明提供了一种对寡核苷酸链上不同碱基位置用脱氧次黄嘌呤进行单替代或多替代，并应用于连接反应的方法。
发明内容
本发明目的是提供一种在寡脱氧核苷酸链上不同的碱基位置用通用碱基脱氧次黄嘌呤进行单位点或多位点替换，并将之应用于寡脱氧核苷酸链连接反应。
本发明采用的技术方案是脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，所述的应用为脱氧次黄嘌呤I作为通用碱基对脱氧寡核苷酸单链中的碱基进行单位点替代或多位点替代，并与被替代脱氧寡核苷酸单链的互补链进行碱基配对，形成脱氧寡核苷酸双链。所述单位点替代为下列之一 (1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3个碱基位点及第3个碱基位点以上的位点替代腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ； (2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第2个碱基位替代鸟嘌呤G或胞嘧啶C ； (3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第1个碱基位替代鸟嘌呤G。所述多位点替代为双位点替代，所述双位点替代为下列之一 1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3和第4个碱基位替代胸腺嘧啶T ；2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T ；3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第4和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T、腺嘌呤A或胞嘧啶C中的一种。所述多位点替代为三位点替代，所述三位点替代为脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟嘌呤G。进一步，所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用推荐按如下步骤进行(1)脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链连接位点第0 5位依次用脱氧次黄嘌呤进行单位点或多位点替代，并人工合成碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链；(2)连接反应将10 μ 1含终浓度均为1 μ M的三条不同的寡核苷酸单链的混合液，在95°C下处理5min后，以1°C /min的速率降温到10°C进行杂交，然后加入10 μ 1的连接液，在10 30°C下连接5 900min，紧接着在65°C下处理15min终止连接反应；(3)电泳检测然后用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳观察连接结果，所述连接液为下列物质的混合液66mM的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(PH7. 6) UOmM的氯化镁、ImM的二硫苏糖醇、7. 5%的PEG 6000、ImMATP和1 IOU的Quick T4连接酶，所述三条不同的寡核苷酸单链为寡核苷酸单链、碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的单链和与被替代的寡核苷酸单链互补的单链。进一步，本发明所述的单位点替代为(1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0 5个碱基位点替代胞嘧啶C 本发明所述脱氧寡核苷酸单链都是从htegrated DNA Technologies公司合成，另有说明的除外，所述碱基A、T、G、C分别为腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、尿嘧啶G和胞嘧啶C ①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6G 5' CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’ ；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤I的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACCCTACCCCCC3’ ；SST30B6C的第25、26、27、28、四、30位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链分别为④SST30B-5I5C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICCCCC3，；
⑤SST30B1C-4I4C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACICCCC3，；⑥SST30B2C-3I3C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCICCC3，；⑦SST30B3C-2I2C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCICC3，；⑧SST30B4C-1I1C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCIC3，；⑨SST30B5C0I :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCI3，；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6个G的单链)。5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B6C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G能与SST30B6C的3，末端的6个C互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C能被连接起来，如图2的A中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40 50bps (base pairs)的清晰条带，若不加入连接酶(图2的A中1所示)，在40 50bps位置没有相应条带；5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B-5I5C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G能与SST30B-5I5C的3，末端的5个C和1个I互补匹配，如图2的A中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B-5I5C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I :G配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B1C-4I4C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 能与 SST30B1C-4I4C 的 3，末端的 4 个 C、1 个 I 和 1个C互补匹配，如图2的A中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B1C-4I4C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“_4”)有I :G配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B2C-3I3C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 能与 SST30B2C-3I3C 的 3，末端的 3 个 C、1 个 I 和 2个C互补匹配，如图2的A中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B2C-3I3C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“_3”)有I :G配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B3C-2I2C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 能与 SST30B3C-2I2C 的 3，末端的 2 个 C、1 个 I 和 3个C互补匹配，如图2的A中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3C-2I2C能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6C，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“_2”)有I :G配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B4C-1I1C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 能与 SST30B4C-1I1C 的 3，末端的 1 个 C、1 个 I 和 4个(互补匹配，如图2的八中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50如8的清晰条带， 说明5，？1108-了217-8 23-6(；与冗巧^^优-口比能被连接起来，而且与阳性对照(冗巧^^已匚， 即没有脱氧次黄嘌呤I替代〉相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边1位 〈“-1”有配对不影响㈨14连接酶的连接作用；
〔0033〕 5，？1108-1217-8^23-66与冗巧^^^⑶〗混合并加入14连接酶， 5，？1108“1217“8？23“66末端的6个6与88X3085001的3，末端的1个I和5个(互补，如 图2的八中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成了 40 50如8大小的较淡条带，说明只有很 少量的5，？1！08“1217“8？23“66与33130850)1能被连接起来，由此说明在连接位点〈“。，，) 有配对的话会极大地影响㈨14连接酶的连接作用；
〔0034〕 综上所述，可见，只有“0”位，即发生连接反应的位点有配对会极大地影响 91110^ 14连接酶的连接作用，而其他位置〈“-5” “-广)的I…配对均没有影响。 〔0035〕 ^脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0 5个碱基位点替 代胸腺嘧啶I
〔0036〕 ①17个碱基长的5’ ~末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链 〔0037〕 5，？1108-12 17 5，1)^X06^6^60X6^66063‘； 〔0038〕 ②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链 〔0039〕 8？23-6八5，0600X0^60X01X06^X^^3‘；
〔0040〕 ③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链 〔0041〕 88X30861 5，‘；
〔0042〕 ④33130861的第25位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X308-5151 5，(^！^了^^^！^！！^^^^^^！^叮打了!^’ ；
〔0043〕 ⑤33130861第26位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X30811-4141 5，1X0X^6^X01X6^X0^0600X^X11X1X3‘；
〔0044〕 ⑥33130861第27位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X30821-3131 5’111X3‘；
〔0045〕 ⑦33130861第28位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X30831-2121 5’11X3’；
〔0046〕 ⑧33130861第29位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X30841-1111 5’1X3’；
〔0047〕 ⑨33130861第30位碱基I被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链 88X3085X01 5’13‘；
〔0048〕 单链5，？1！08“1217和单链8？23-6八经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合 体〈5’ ？1！081217-8？23-6八〉，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个八(卯斤^)的粘末 端〈6个八的单链〉。
〔0049〕① 5，？1108-1217-8^23-6^ 与 33130861 混合并加入14 连接酶， 5，？1108-1217-8^23-6八末端的6个八能与33130861的3，末端的6个I互补匹配，从而， 5，？1！08“1217“8？23“6^与33130861能被连接起来，如图2的8中2所示，在聚丙烯酰胺凝 胶上形成40 50如8的清晰条带，若不加入连接酶(图2的8中1所示〉，在40 50^8 位置没有相应条带；
②5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B-5I5T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B-5I5T的3，末端的5个T和1个I互补匹配，如图2的B中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B-5I5T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I:A配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B1T-4I4T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 能与 SST30B1T-4I4T 的 3，末端的 4 个 T、1 个 I 和 1个T互补匹配，如图2的B中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B1T-4I4T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“_4”)有I :A配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；④5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B2T-3I3T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 能与 SST30B2T-3I3T 的 3，末端的 3 个 T、1 个 I 和 2个T互补匹配，如图2的B中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B2T-3I3T能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“_3”)有I :A配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑤5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B3T-2I2T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B3T-2I2T的3，末端的2个T、1个I和3个T互补匹配，如图2的B中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3T-2I2T能被连接起来；与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边2位(“_2”)有I A配对会对Quick T4连接酶的连接作用有一定的负面影响，但不会完全抑制连接酶活性；⑥5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B4T-1I1T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 能与 SST30B4T-1I1T 的 3，末端的 1 个 T、1 个 I 和 4个T互补匹配，如图2的B中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B4T-1I1T能被连接起来，与阳性对照(SST30B6T，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有明显下降，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I:A配对会对Quick T4连接酶的连接作用有一定的负面影响；与“-2”I:A配对相比，影响变强，但仍然不会完全抑制连接酶活性；⑦5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B5T0I 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A与SST30B5T0I的3，末端的1个I和5个T互补，如图2的B中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上没有形成40 50bps大小的较淡条带，说明5,Phos-TE17-BP23-6A与SST30B5T0I不能被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:A配对会完全抑制了 Quick T4连接酶的连接作用；综上所述，可见，在连接位点旁边第3位(“-3”)及以上有I:A配对不会影响QuickT4连接酶的连接作用；“_2”和“_1”位有I:A配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用；而“0”位有I :A配对会完全抑制Quick T4连接酶的连接作用。(3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0 5个碱基位点替代腺嘌呤A :①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；④SST30B6A的第25位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I5A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAAAAA3，；⑤SST30B6A第沈位碱基A被脱氧次黄嘌呤SST30B1A-4I4A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIAAAA3’ ；⑥SST30B6A第27位碱基A被脱氧次黄嘌呤SST30B2A-3I3A 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAIAAA3，；⑦SST30B6A第观位碱基A被脱氧次黄嘌呤SST30B3A-2I2A 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAIAA3，；⑧SST30B6A第四位碱基A被脱氧次黄嘌呤SST30B4A-1I1A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAIA3’ ；⑨SST30B6A第30位碱基C被脱氧次黄嘌呤SST30B5A0I :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAI3’ ；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Wios-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(PolyT6)的粘末端(6个T的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B6A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3，末端的6个A互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图2的C中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40 50bps的清晰条带，若不加入连接酶(图2的C中1所示)，在40 50bps位置没有相应条带；②5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B-5I5A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B-5I5A的3，末端的5个A和1个I互补匹配，如图2的C中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B-5I5A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I :T配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B1A-4I4A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 能与 SST30B1A-4I4A 的 3，末端的 4 个 A、1 个 I 和 1个A互补匹配，如图2的C中4所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B1A-4I4A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，
I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“_4”)有I :T配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；④5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B2A-3I3A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 能与 SST30B2A-3I3A 的 3，末端的 3 个 A、1 个 I 和 2个A互补匹配，如图2的C中5所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B2A-3I3A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“_3”)有I:T配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑤5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B3A-2I2A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 能与 SST30B3A-2I2A 的 3，末端的 2 个 A、1 个 I 和 3个A互补匹配，如图2的C中6所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B3A-2I2A能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“_2”)有I:T配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑥5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B4A-1I1A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B4A-1I1A的3，末端的1个A、1个I和4个A互补匹配，如图2的C中7所示，在酰胺聚丙烯凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B4A-1I1A能被连接起来，与阳性对照(SST30B6A，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边1位(“-Γ’)有I :T配对在一定程度上影响Quick T4连接酶的连接作用，但不会完全一致连接酶活力；⑦5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B5A0I 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T与SST30B5A0I的3，末端的1个I和5个A互补，如图2的C中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上基本没有形成40 50bps大小的条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B5A0I基本没有被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I :T配对的话会极大地影响Quick T4连接酶的连接作用；综上所述，可见，在连接位点旁边第2位(“-2”)及以上有I:T配对不会影响QuickT4连接酶的连接作用；“_1”位有I:T配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用；而“0”位有I T配对会基本完全抑制Quick T4连接酶的连接作用。(4)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第0 5个碱基位点替代鸟嘌呤G ①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6C 5' CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’ ；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3，；④SST30B6G的第25位碱基G被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I5G :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIGGGGG3，；
⑤SST30B6G第沈位碱基G被脱氧次黄嘌呤SST30B1G-4I4G :5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGIGGGG3，；⑥SST30B6G第27位碱基G被脱氧次黄嘌呤SST30B2G-3I3G 5'GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGIGGG3，；⑦SST30B6G第观位碱基G被脱氧次黄嘌呤SST30B3G-2I2G 5'GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGIGG3，；⑧SST30B6G第四位碱基G被脱氧次黄嘌呤SST30B4G-1I1G 5'GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGIG3，；⑨SST30B6G第30位碱基G被脱氧次黄嘌呤SST30B5G0I :5’GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGI3，；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6C经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6C)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个C(polyC6)的粘末端(6个C的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B6G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B6G的3，末端的6个G互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G能被连接起来，如图2的D中2所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40 50bps的清晰条带，若不加入连接酶(图2的D中1所示)，在40 50bps位置没有相应条带；②5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B-5I5G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B-5I5G的3，末端的5个G和1个I互补匹配，如图2的D中3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B-5I5G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边5位(“-5”)有I :C配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B1G-4I4G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C 末端的 6 个 C 能与 SST30B1G-4I4G 的 3，末端的 4 个 G、1 个 I 和 1个G互补匹配，如图2的D中4所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B1G-4I4G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边4位(“_4”)有I :C配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；④5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B2G-3I3G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C 末端的 6 个 C 能与 SST30B2G-3I3G 的 3，末端的 3 个 G、1 个 I 和 2个G互补匹配，如图2的D中5所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B2G-3I3G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，
I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链I替代的寡脱氧核苷酸链即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边3位(“_3”)有I :C配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑤5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B3G-2I2G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C 末端的 6 个 C 能与 SST30B3G-2I2G 的 3，末端的 2 个 G、1 个 I 和 3个G互补匹配，如图2的D中6所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3G-2I2G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边2位(“_2”)有I:C配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑥5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B4G-1I1G 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C 末端的 6 个 C 能与 SST30B4G-1I1G 的 3，末端的 1 个 G、1 个 I 和 4个G互补匹配，如图2的D中7所示，在聚丙烯酰胺凝胶上也形成40 50bps的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B4G-1I1G能被连接起来，而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度基本一致，由此说明在连接位点旁边1位(“-1”)有I :C配对不影响Quick T4连接酶的连接作用；⑦5，Phos-TE17-BP23-6C 与 SST30B5G0I 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C与SST30B5G0I的3，末端的1个I和5个G互补，如图2的D中8所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成了 40 50bps大小的清晰条带，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B5G0I能被连接起来，由此说明在连接位点(“0”)有I:G配对的话会极大地影响QuickT4连接酶的连接作用；而且与阳性对照(SST30B6G，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度下降不多，由此说明在连接位点(“0”)有I:C配对Quick T4连接酶的连接作用影响不大；综上所述，可见，只有“0”位，即发生连接反应的位点有I :C配对会轻微地影响Quick T4连接酶的连接作用，而其他位置(“-5” “-1”)的I:C配对均没有影响。进一步，本发明所述的三位点替代为鉴于在连接位点旁边第5、4或3位(“_5”、“_4”或“_3”位)掺入I均对I :G、I:A、I:T和I :C配对完全不影响连接酶作用，而在连接位点旁边第2、1或0位(“-2”、“-1”或“0”位)掺入I对I :G、I A、I T和I C配对会产生不一样的连接反应影响，我们尝试在“ -5 ”、“ -4 ”和“ -3 ”位同时掺入3个I，考察31 3G、31 3A、31 3T和31 3C配对对连接酶作用的影响。(a)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代胞嘧啶C，与鸟嘌呤G配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5， Phos-TE 17 :5， pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6G 5’ CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3’ ；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6C 5 ’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3 ’ ；④SST30B6C的第25 J6和27位碱基C均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链
SST30B3I3C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIICCC3，；单链5’ Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6个G的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G能与SST30B6C的3，末端的6个C互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C能被连接起来，如图3中1所示，在聚丙烯酰胺凝胶上形成40 50bps的清晰条带；②5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3I3C混合并加入QuickT4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30B3I3C的3，末端的3个C+3个I配对，如图3中2所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生，说明5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B3I3C不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4和3( “-5”、“-4”和“_3”)碱基位同时有3个I:G配对完全抑制了 Quick T4连接酶的连接作用。(b)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T，与腺嘌呤A配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5， Phos-TE 17 :5， pTTCGGAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6A 5' CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3，；④SST30B6T的第25 J6和27位碱基T均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B3I3T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIITTT3‘；单链5’ Phos-TE17和单链BP23-6A经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Wios-TE17-BP23-6A)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个A(PolyA6)的粘末端(6个A的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B6T的3，末端的6个T互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T能被连接起来，如图3泳道3所示，在聚丙烯酰胺凝胶上40 50bps位置处有清晰的目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23_6A末端的6个A与SST30B3I3T的3，末端的3个T+3个I配对，如图3泳道4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4和3( “-5”、“-4”和“_3”)碱基位同时有3个I:A配对完全抑制了 Quick T4连接酶的连接作用。(c)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代腺嘌呤A，与胸腺嘧啶T配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链
BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；④SST30B6A的第25 J6和27位碱基A均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B3I3A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIAAA3‘；单链5’ Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Wios-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(PolyT6)的粘末端(6个T的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3，末端的6个A互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图3泳道5所示，聚丙烯酰胺凝胶上形成40 50bps大小的清晰目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B3I3A混合并加Λ Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23_6T 末端的 6 个 T 与 SST30B3I3A 的 3，末端的 3 个A+3个I配对，如图3泳道6所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置没有清晰条带，即没有连接产物产生，说明5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B3I3T不能被连接起来，由此说明在连接位点旁边第5、4和3( “-5”、“-4”和“_3”)碱基位同时有3个I:T配对完全抑制了QuickT4连接酶的连接作用。(d)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟嘌呤G，与胞嘧啶C配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5， Phos-TE 17 :5， pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6C 5' CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3，；④SST30B6G的第25 J6和27位碱基G均被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B3I3G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAI IIGGG3 ‘；单链5’ Phos-TE17和单链BP23-6C经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6C)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个C(polyC6)的粘末端(6个C的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6C末端的6个C能与SST30B6G的3，末端的6个G互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B6G能被连接起来，如图3泳道7所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps大小位置有清晰的目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3I3G混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23_6C末端的6个C与SST30B3I3G的3，末端的3个G+3个I配对，如图3泳道8所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置有清晰目的条带，即有连接产物产生，说明5，Phos-TE17-BP23-6C与SST30B3I3G能被连接起来；而且，产物浓度与对照(没有掺入I，泳道7)基本一致，由此说明在连接位点旁边第5、4和3 (“-5”、“-4”和“_3”)碱基位同时有3个I:C配对完全不影响Quick T4连接酶的连接作用。
进一步，本发明所述双位点替代为鉴于在连接位点旁边第5、4或3位(“-5”、“_4”或“_3”位)掺入单个I形成I:G、I :A、I :T和I :C配对后完全不影响连接酶作用，而同时掺入3个I形成31 3G、3I 3A、3I 3T和31 3C配对会产生不一样的连接反应影响(31 3G、3I 3A和31 3T配对均完全抑制连接反应，而31:3C配对完全不影响连接反应)，我们尝试在“_5”、“_4”和“_3”位同时掺入2个I，来考察21 2G、2I 2A和21 2T配对对连接酶作用的影响(不用考察21 2C配对对连接酶作用的影响)。1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4和第5位碱基位替代胞嘧啶C，与鸟嘌呤G配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6G 5' CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3，；④SST30B6C第沈和27位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B1C-4I-3I3C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACIICCC3，；⑤SST30B6C第25和27位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I1C-3I3C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICICCC3，；⑥SST30B6C第25和沈位碱基C被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I-4I4C 5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIICCCC3‘；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6G经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’Phos-TE17-BP23-6G)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个G(polyG6)的粘末端(6个G的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B6C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G能与SST30B6C的3，末端的6个C互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6G与SST30B6C能被连接起来，如图4中的9所示，聚丙烯胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B1C-4I-3I3C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G末端的6个G与SST30BlC-4I-3I3C 的 3，末端的 1 个C和 2 个 I (“-4”和“_3”位)+3个C配对，如图4中10所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置上基本没有目的条带，说明在连接位点旁边第4和3位(“-4”和“_3”)同时有2个I:G配对会完全抑制Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B-5I1C-3I3C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 与 SST30B-5I1C-3I3C 的 3，末端的 1 个 I ( “_5”位)、1个C和1个I (“-3”位)+3个C配对，如图4中11所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处基本没有目的条带，说明在连接位点旁边5和3位(“-5”和“_3”)同时有2个I:G配对会完全抑制Quick T4连接酶的连接作用；
④5，Phos-TE17-BP23-6G 与 SST30B-5I-4I4C 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6G 末端的 6 个 G 与 SST30B-5I-4I4C 的 3，末端的 2 个 I ( “-5”和“-4，，)和4个C配对，如图4中12所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处有微弱的目的条带，与阳性对照(SST30B6C，图4中9所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度下降明显，由此说明在连接位点旁边5和4位(“_5”和“_4”位)有2个I:G配对会对Quick T4连接酶的连接作用有较大影响。2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4和第5位碱基位替代胸腺嘧啶T，与腺嘌呤A配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6A 5' CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3，；④SST30B6T第沈和27位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B1T-4I-3I3T :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATIITTT3‘；⑤SST30B6T第25和27位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I1T-3I3T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITITTT3‘；⑥SST30B6T第25和沈位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I-4I4T 5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIITTTT3‘；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6A经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Wios-TE17-BP23-6A)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个A(PolyA6)的粘末端(6个A的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B6T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A末端的6个A能与SST30B6T的3，末端的6个T互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6A与SST30B6T能被连接起来，如图4泳道1所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B1T-4I-3I3T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 与 SST30B1T-4I-3I3T 的 3，末端的 1 个 T+2 个 I (“-4”和“_3”位)+3个T配对，如图4中2所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置上有目的条带，但与阳性对照(SST30B6T，图4中1所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度较低，说明在连接位点旁边4和3位(“-4”和“_3”)同时有2个I A配对会极大地影响Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B-5I1T-3I3T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 与 SST30B-5I1T-3I3T 的 3，末端的 1 个 1(“_5”位)+1个T+1个I ( “_3”位)+3个T配对，如图4中3所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处有目的条带，但与阳性对照(SST30B6T，图4中1所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度较低，说明在连接位点旁边第5和3位(“-5”和“_3”)同时有2个I:A配对会极大地影响Quick T4连接酶的连接作用；④5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B-5I-4I4T 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6A 末端的 6 个 A 与 SST30B-5I-4I4T 的 3，末端的 2 个 I (“-5”和“_4，，)+4个T配对，如图4中4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处有清晰的目的条带，说明 5，Phos-TE17-BP23-6A 与 SST30B-5I-4I4T 能被连接起来，与阳性对照(SST30B6T，图 4中1所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边5和4位(“_5”和“_4”位)有2个I:A配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用。3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第4位、第3和第5位，第4和第5位碱基位替代腺嘌呤A，与胸腺嘧啶T配对①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；③30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；④SST30B6A第沈和27位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B1A-4I-3I3A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIIAAA3，；⑤SST30B6A第25和27位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I1A-3I3A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAIAAA3，；⑥SST30B6A第25和沈位碱基A被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链SST30B-5I-4I4A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIAAAA3，；单链5，Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Wios-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(PolyT6)的粘末端(6个T的单链)。①5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B6A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3，末端的6个A互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图4中5所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；②5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B1A-4I-3I3A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 与 SST30B1A-4I-3I3A 的 3，末端的 1 个 A+2 个 I (“-4”和“_3”位)+3个A配对，如图4中6所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置上基本没有目的条带，说明在连接位点旁边第4和3位(“-4”和“_3”)同时有2个I:T配对会基本上完全抑制Quick T4连接酶的连接作用；③5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B-5I1A-3I3A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 与 SST30B-5I1A-3I3A 的 3，末端的 1 个 I (“_5”位)+1个A+1个I ( “_3”位)+3个A配对，如图4中7所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处有一微弱的目的条带，与阳性对照(SST30B6A，图4中5所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度极低，说明在连接位点旁边第5和3位(“-5”和“_3”)同时有2个I :T配对会极大地影响Quick T4连接酶的连接作用；④5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B-5I-4I4A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T 末端的 6 个 T 与 SST30B-5I-4I4A 的 3，末端的 2 个 I (“-5”和“_4，，)+4个A配对，如图4中8所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处有清晰的目的条带，说明 5，Phos-TE17-BP23-6T 与 SST30B-5I-4I4A 能被连接起来，与阳性对照(SST30B6A，图 4中5所示，即没有脱氧次黄嘌呤I替代)相比，连接产物浓度有所下降，由此说明在连接位点旁边第5和4位(“_5”和“_4”位)有2个I:T配对会部分影响Quick T4连接酶的连接作用。另一方面，本发明所述脱氧次黄嘌呤I的掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度①17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸链5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；②23个碱基长的特异性寡脱氧核苷酸链BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；③BP23-6T减少3’末端2个碱基T的特异性寡脱氧核苷酸链(21个碱基长)BP21-4T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTT3，；④BP23-6T第18和19位碱基T被脱氧次黄嘌呤I替代的寡脱氧核苷酸链(即BP21-4T在第18和19位掺入2个脱氧次黄嘌呤I)BP23-5I-4I4T 5' CGCCTCAGCTCTTCGATIITTTT3‘⑤30个碱基长且没有掺入脱氧次黄嘌呤的特异性寡脱氧核苷酸链SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；单链5’ Phos-TE17和单链BP23-6T经常规杂交反应后，能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP23-6T)，此杂合体一边为平末端，另一边是一个6个T(PolyT6)的粘末端(6个T的单链)。5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-6T末端的6个T能与SST30B6A的3，末端的6个A互补匹配，从而，5，Phos-TE17-BP23-6T与SST30B6A能被连接起来，如图5中2所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；而没有加入连接酶的阴性对照(图5中1所示)没有目的条带。而单链5’ Phos-TE17和单链BP21-4T经常规杂交反应后，也能互补匹配形成双链杂合体(5’ Phos-TE17-BP21-4T)，此杂合体一边也为平末端，另一边却是一个4个T (PolyT4)的粘末端G个T的单链)，而不是6个T (PolyT6)的粘末端(图5中2所示)。5，Phos-TE17-BP21-4T 与 SST30B6A 混合并加入 Quick T4 连接酶，5，Phos-TE17-BP21_4T末端只有4个T能与SST30B6A的3，末端的4个A互补匹配，5，Phos-TE17-BP21_4T与SST30B6A也能被连接起来，如图5中3所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；但是，与对照(图5中2所示)相比，由于减少了 2个有效碱基匹配0个T:A匹配)，导致热稳定性降低，从而连接产物(目的条带)浓度有比较明显的下降。当在单链BP21-4T第18和19位掺入2个脱氧次黄嘌呤I，或者说单链BP23-6T的第18和19位碱基T被2个脱氧次黄嘌呤I替代，变成BP23-5I-4I4T。单链5，Phos-TE17和单链BP23-5I-4I4T经常规杂交反应后，也能互补匹配形成双链杂合体(5’Phos-TE17-BP23-5I-4I4T)，此杂合体一边也为平末端，另一边却是一个2个I和4个T的粘末端，再与SST30B6A混合并加入Quick T4连接酶，5，Phos-TE17-BP23-5I_4I4T末端2个I和4个T能与SST30B6A的3，末端的6个A互补匹配(包含“_5”和“_4”位的I A配对)，5，Phos-TE17-BP23-5I-4I4T与SST30B6A也能被连接起来，如图5中4所示，聚丙烯酰胺凝胶上在40 50bps位置处形成清晰的目的条带；而且与阳性对照(没有掺入I，图5中2所示)相比，连接产物(目的条带)浓度基本不变，说明在连接位点旁边5和4位(“-5”和“-4”)同时有2个I:T配对后对Quick T4连接酶的连接作用影响不大；而与另一对照(只有4个T:A配对，图5中3所示)相比，连接产物浓度有明显增强，说明脱氧次黄嘌呤I的掺入可以提高寡核苷酸的有效连接长度，从而提高配对寡核苷酸链的热稳定性，由此提高连接效率。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种脱氧次黄嘌呤作为通用碱基在寡脱氧核苷酸链连接反应中应用的方法，本发明通过在寡脱氧核苷酸单链上进行单位点或多位点替代脱氧次黄嘌呤，从而提高寡脱氧核苷酸单链有效连接长度或降低寡脱氧核苷酸链文库大小，本发明所述的脱氧次黄嘌呤作为通用碱基相比于硝基吡咯等其他通用碱基，较易被公司合成，故具有经济、方便等优点。
图1寡脱氧核苷酸链设计和连接反应示意图，其中5’Phos_TE17为17个碱基长的5’ -末端磷酸化的特异性寡脱氧核苷酸单链；BP23为23个碱基长的寡脱氧核苷酸单链，17个碱基长的黄色区域与5’ Phos-TE17互补匹配，6个碱基长的绿色区按要求进行脱氧次黄嘌呤的替代，根据离开连接位点的距离不同，替代位置分别标记为0、-1、-2、-3、-4和-5 ；SST30B为30个碱基长的寡脱氧核苷酸单链，6个碱基长的绿色区与BP23单链的绿色区互补匹配；图2脱氧次黄嘌呤I单位点替代对QuickT4连接酶作用的影响，其中(A)为I对C的替代，⑶为I对T的替代，(C)为I对A的替代，⑶为I对G的替代，(A) ⑶中1 8为泳道，0 -5为替代位点，M为标准分子量泳道，a为目的条带；图3脱氧次黄嘌呤I三位点替代对Quick T4连接酶作用的影响，其中“ + ”表示有脱氧次黄嘌呤I替代；“-”表示没有脱氧次黄嘌呤I替代，1 8为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的条带；图4双位点脱氧次黄嘌呤I替代对Quick T4连接酶作用的影响，其中“ + ”表示有脱氧次黄嘌呤I替代，“-”表示没有脱氧次黄嘌呤I替代；1 12为泳道，其中泳道1 4为I对T的替代，泳道5 8为I对A的替代，泳道9 12为I对C的替代；M为标准分子量泳道，-3 -5为替代位置，a为目的条带；图5脱氧次黄嘌呤I掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度，1 4为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的条带；图6连接时间对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1 5为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的条带，0 900为连接时间(min)；图7连接酶量对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1 5为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的条带，0、0.5、1、2和5分别表示连接酶量(U)；
图8连接温度对脱氧次黄嘌呤I在-3位替代碱基T对连接反应的影响，1 5为泳道，M为标准分子量泳道，a为目的条带，10 30为连接温度(V )；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此所述单链均为 Integrated DNA Technologies 公司合成。实施例1寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I单位点替代而产生的I :G、I :A、I :T和I :C配对的Quick T4连接酶作用下的连接反应5，Phos-TE17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；BP23-6G 5' CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3，；SST30B6C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3，；SST30B-5I5C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICCCCC3，；SST30B1C-4I4C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACICCCC3’SST30B2C-3I3C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCICCC3’SST30B3C-2I2C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCICC3’SST30B4C-1I1C :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCIC3’SST30B5C0I :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCI3，；BP23-6A 5' CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3，；SST30B6T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3，；SST30B-5I5T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITTTTT3，；SST30B1T-4I4T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATITTTT3‘SST30B2T-3I3T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTITTT3‘SST30B3T-2I2T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTITT3‘SST30B4T-1I1T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTIT3‘SST30B5T0I 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTT13‘；BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；SST30B-5I5A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAAAAA3，；SST30B1A-4I4A 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIAAAA3'SST30B2A-3I3A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAIAAA3'SST30B3A-2I2A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAIAA3'SST30B4A-1I1A 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAIA3'SST30B5A0I :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAI3，；BP23-6C 5' CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3，；SST30B6G 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3，；SST30B-5I5G 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIGGGGG3，；SST30B1G-4I4G 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGIGGGG3'SST30B2G-3I3G :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGIGGG3'
SST30B3G-2I2G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGIGG3，；SST30B4G-1I1G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGIG3，；SST30B5G0I :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGI3，；然后用pH8. 0的TE缓冲液(IOmM三羟甲基胺基甲烷-盐酸Tris-HCl，ImM乙二胺四乙酸EDTA)将以上寡核苷酸链均配制成浓度为ΙΟμΜ的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下32个反应组反应组1 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 BP23-6G，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6C以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组2:同反应组1;反应组3 反应组1中SST30B6C用SST30B-5I5C替代；反应组4 反应组1中SST30B6C用SST30B1C-4I4C替代反应组5 反应组1中SST30B6C用SST30B2C-3I3C替代反应组6 反应组1中SST30B6C用SST30B3C-2I2C替代
反应组7 反应组1中SST30B6C用SST30B4C-11IC替代反应组8 反应组1中SST30B6C用SST30B5C0I替代；反应组9 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Α，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6T以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组10 同反应组9 ；反应组11 反应组9中SST30B6T用SST30B-5I5T替代；反应组12 反应组 9 中 SST30B6T 用 SST30B1T-4I4T 替代反应组13 反应组 9 中 SST30B6T 用 SST30B2T-3I3T 替代反应组14 反应组 9 中 SST30B6T 用 SST30B3T-2I2T 替代反应组15 反应组 9 中 SST30B6T 用 SST30B4T-1I1T 替代反应组16 反应组9中SST30B6T用SST30B5T0I替代；反应组17 :lμl浓度为10μM的5，Phos-TE17加上lμl浓度为10μM的BP23-6T，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6A以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组18 同反应组17 ；反应组19 反应组 17 中 SST30B6A 用 SST30B-5I5A 替代；反应组20 反应组 17 中 SST30B6A 用 SST30B1A-4I4A 替代反应组21 反应组 17 中 SST30B6A 用 SST30B2A-3I3A 替代反应组22 反应组 17 中 SST30B6A 用 SST30B3A-2I2A 替代反应组23 反应组 17 中 SST30B6A 用 SST30B4A-1I1A 替代反应组M 反应组17中SST30B6A用SST30B5A0I替代；反应组25:1μ 1 浓度为 10yM&5，Phos-TE17Wily 1 浓度为 10 μ M的BP23-6C，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6G以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组沈同反应组25 ；反应组27 反应组 25 中 SST30B6G 用 SST30B-5I5G 替代；反应组28 反应组 25 中 SST30B6G 用 SST30B1G-4I4G 替代；反应组四反应组25中SST30B6G用SST30B2G-3I3G替代；
反应组30 反应组 25 中 SST30B6G 用 SST30B3G-2I2G 替代；反应组31 反应组 25 中 SST30B6G 用 SST30B4G-1I1G 替代；反应组32 反应组25中SST30B6G用SST30B5G0I替代；(1)连接反应将32个反应组在95°C下处理5min后，以1°C /min的速率降温到10°c，然后各加入 ομ 1的连接液(66mM的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(pH7. 6)、10mM的氯化镁、ImM的二硫苏糖醇、7. 5%的PEG 6000、lmM ATP和2U的Quick !"4连接酶)，反应组2、10、18和沈中不加入Quick T4连接酶作为阴性对照；然后将32组均在25°C下连接30min，紧接着在65°C处理15min终止连接反应。( 电泳检测然后用10%的聚丙烯酰胺凝胶(IOmL的10%聚丙烯酰胺凝胶含有3. 3mL的30%丙烯酰胺溶液，6 μ 1的TEMED，100 μ 1的10%过硫酸铵溶液，ImL的5XTBE溶液和5. 6mL的水，其中5XTBE溶液配方为三羟甲基胺基甲烷，27. 5g/L的硼酸，IOmM的乙二胺四乙酸二钠，用盐酸调pH至8. 0)，在200毫伏电压下电泳45min，电泳结束后，在0. 5XTBE溶液中将聚丙烯酰胺凝胶用STOR Green I核酸染料染色20min后，观察连接结果。如图2所示A中I :G配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4、3、2 或 1( “-5”、“-4”、“-3”、“-2” 或“_1”，也就是反应组 3、4、5、6、7，即图 2 的 A 中 3、4、5、6、7所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组1，即图2的A中2所示泳道在聚丙烯凝胶上形成40 50bps的清晰条带，M代表的泳道为标准分子量条带)基本一致，当替代位置在连接位置时(“0”，也就是反应组8，即图2的A中8所示泳道)，对连接反应产生了极大影响，目的条带浓度极低。阴性对照没有连接产物(反应组2，即图2的A中1所示泳道在40 50bps没有相应条带)；B中I :A配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4或3 ( “-5”、“-4”或“_3”，也就是反应组11、12、13，即图2的B中3、4、5所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组9，即图2的B中2所示泳道)基本一致。随着替代位置进一步向连接位置靠近，即连接位置旁边第2、1或0位(“_2”、“-1”或“0”，也就是反应组14、15、16，即图2的B中6、7、8所示泳道)，对连接反应影响越来越大，当替代位置在连接位置时(“0”，即图2的B中8所示泳道)，基本没有连接产物。阴性对照也没有连接产物(反应组10，即图2的B中1所示泳道)；C中I:T配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4或3( “_5”、“_4”或“_3”，也就是反应组19、20、21，即图2的C中3、4、5所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组17，即图2的C中2所示泳道)基本一致。随着替代位置进一步向连接位置靠近，即连接位置旁边第2、1或0位(“-2”、“-1”或“0”，也就是反应组22、23、对，即图2的C中6、7、8所示泳道)，对连接反应影响越来越大，当替代位置在连接位置时(“0”，也就是反应组24，即图2的C中8所示泳道)，连接产物浓度变得非常低。阴性对照也没有连接产物(反应组18，即图2的C中1所示泳道)；D中I:C配对时，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第5、4、3、2或1( “_5”、“_4”、“-3”、“-2”或“-1”，也就是反应组27、沘、29、30、31，即图2的D中3、4、5、6、7所示泳道)碱基位时，对连接反应基本没有影响，目的产物浓度与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组25，即图2的D中2所示泳道)基本一致，当替代位置在连接位置时(“0”，也就是反应组32，即图2的D中8所示泳道)，连接产物浓度也较理想，影响不大，而阴性对照没有连接产物(反应组26，即图2的D中1所示泳道)。综上可见，当脱氧次黄嘌呤I替代位置在连接位置旁边第3位碱基远以上，对各种配对(I:G、I:A、I:T和I:C)下的Quick T4连接酶作用均没有影响，如果替代位置进一步靠近连接位点，对不同的配对下的Quick T4连接酶作用不一样的影响，而且，替代位置越靠近连接位置，影响越大，尤其是当替代位置就在连接位置上时，对I :G、I A和I T配对下的Quick T4连接酶作用均产生极大影响。实施例2寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I三位点替代而产生的I :G、I :A、I :T和I :C配对的Quick T4连接酶作用下的连接反应5，Phos-TE17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；BP23-6G 5' CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3，；SST30B6C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3，；SST30B3I3C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIICCC3‘；BP23-6A 5' CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3，；SST30B6T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3，；SST30B3I3T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIITTT3‘；BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；SST30B3I3A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIIAAA3‘；BP23-6C 5’ CGCCTCAGCTCTTCGATCCCCCC3’ ；SST30B6G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAGGGGGG3，；SST30B3I3G :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAI IIGGG3 ‘；用pH8.0的TE缓冲液(IOmM三羟甲基胺基甲烷-盐酸"Tris-HCl，ImM乙二胺四乙酸EDTA)将以上寡核苷酸链均配制成浓度为ΙΟμΜ的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下8个反应组反应组1 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 BP23-6G，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6C以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组2 反应组1中SST30B6C用SST30B3I3C替代；反应组3 :1μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Α，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6T以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组4 反应组3中SST30B6T用SST30B3I3T替代；反应组5 :1μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Τ，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6A以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组6 反应组5中SST30B6A用SST30B3I3A替代；反应组7 :1μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 BP23-6C，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6G以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组8 反应组7中SST30B6G用SST30B3I3G替代；上述8个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图3。如图3所示当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3( “-5”、“_4”和“_3”，即图3中2所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I G配对时(反应组2)，基本没有连接产物，而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“_5”、“_4”和“_3”均为C:G配对，也就是反应组1，即图3中1所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3( “-5”、“-4”和“_3”，即图3中4所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:A配对时(反应组4)也基本没有连接产物，而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“_5”、“_4”和“_3”均为T:A配对，即反应组3，图3中3所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3( “-5”、“-4”和“_3”，即图3中6所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:T配对时(反应组6)也基本没有连接产物，而没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“_5”、“-4”和“_3”均为Α:Τ配对，即反应组5，图3中5所示泳道)有清晰的目的产物；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3( “_5”、“_4”和“_3”，即图3中8所示泳道)碱基位有3个替代而产生3个I:C配对时(反应组8)有清晰的连接产物，而且与对照即没有脱氧次黄嘌呤I替代时(“_5”、“_4”和“_3”均为G:C配对，即反应组7，图3中7所示泳道)相比，连接产物浓度基本一致。综上可见，当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3碱基位同时有3个替代时，对I:G、I :A和I :T配对下的Quick T4连接酶作用均有极大的影响，而对I :C配对下的连接反应没有影响。实施例3寡核苷酸链上脱氧次黄嘌呤I双位点替代而产生的I:G、I:A、和I:T配对的Quick T4连接酶作用下的连接反应5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；BP23-6A 5' CGCCTCAGCTCTTCGATAAAAAA3，；SST30B6T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATTTTTT3，；SST30B1T-4I-3I3T :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTATIITTT3‘；SST30B-5I1T-3I3T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAITITTT3‘；SST30B-5I-4I4T :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIITTTT3‘；BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；SST30B1A-4I-3I3A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAIIAAA3，；SST30B-5I1A-3I3A :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIAIAAA3，；SST30B-5I-4I4A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAIIAAAA3‘；BP23-6G 5' CGCCTCAGCTCTTCGATGGGGGG3，；SST30B6C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACCCCCC3，；SST30B1C-4I-3I3C :5’ GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTACIICCC3，；SST30B-5I1C-3I3C 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAICICCC3'；SST30B-5I-4I4C 5' GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAI ICCCC3'；用pH8.0的TE缓冲液(IOmM三羟甲基胺基甲烷-盐酸"Tris-HCl，ImM乙二胺四乙酸EDTA)将以上寡核苷酸链均配制成浓度为ΙΟμΜ的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下12个反应组反应组1 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Α，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6T以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组2 反应组 1 中 SST30B6T 用 SST30B1T-4I-3I3T 替代；
反应组3 反应组 1 中 SST30B6T 用 SST30B-5I1T-3I3T 替代；反应组4 反应组 1 中 SST30B6T 用 SST30B-5I-4I4T 替代；反应组5 :1μ 1 浓度为 ΙΟμΜ 的 5，Phos_TE17加上 1μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Τ，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6A以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组6 反应组 5 中 SST30B6A 用 SST30B1A-4I-3I3A 替代；反应组7 反应组 5 中 SST30B6A 用 SST30B-5I1A-3I3A 替代；反应组8 反应组 5 中 SST30B6A 用 SST30B-5I-4I4A 替代；反应组9 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 BP23-6G，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6C以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组10 反应组 9 中 SST30B6C 用 SST30B1C-4I-3I3C 替代；反应组11 反应组 9 中 SST30B6C 用 SST30B-5I1C-3I3C 替代；反应组12 反应组 9 中 SST30B6C 用 SST30B-5I-4I4C 替代；上述12个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图4。如图4所示当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第4和3 (“-4”和“_3”，也就是反应组2，即图4中2所示泳道)碱基位或者在连接位置旁边第5和3( “_5”和“_3”，也就是反应组3，即图4中3所示泳道)碱基位同时有2个替代而产生2个Ι:Α配对时，对连接反应影响较大，目的产物浓度较低，与没有脱氧次黄嘌呤I替代的反应(反应组1，即图4中1所示泳道)相比，浓度有极大的降低，当2个替代位置在连接位置旁边第5和4 (反应组4，即“-5”和“_4”，即图4中4所示泳道)碱基位时，对连接反应影响有所减轻，目的条带浓度有所增加，但跟对照(也就是没有替代，反应组1，即图4中1所示泳道)相比，连接产物浓度还是有较大降低；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第4和3(“-4”和“_3”，也就是反应组6，即图4中6所示泳道)碱基位或者在连接位置旁边第5和3( “_5”和“_3”，也就是反应组7，即图4中7所示泳道)碱基位同时有2个替代而产生2个I :Τ配对时，对连接反应影响非常大，目的产物浓度极低，当2个替代位置在连接位置旁边第5和4( “_5”和“_4”，也就是反应组8，即图4中8所示泳道)碱基位，对连接反应影响有所减轻，目的条带浓度有所增加，但跟对照(没有脱氧次黄嘌呤I替代，也就是反应组5，即图4中5所示泳道)相比，浓度仍有极大的降低；当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第4和3( “_4”和“_3”，也就是反应组10，即图4中10所示泳道)碱基位或者在连接位置旁边第5和3( “_5”和“_3”，也就是反应组11，即图4中11所示泳道)碱基位同时有2个替代而产生2个I:G配对时，基本完全抑制连接反应而没有目的产物，甚至当2个替代位置在连接位置旁边第5和4 (“-5”和“_4”，也就是反应组12，即图4中12所示泳道)碱基位时，对连接反应影响仍然极大，目的条带浓度极其微弱，跟对照(也就是没有替代，反应组9，即图4中9所示泳道)相比，连接产物浓度下降非常明显。综上可见，当脱氧次黄嘌呤I在连接位置旁边第5、4和3位碱基位中任意2位同时有2个替代时，对I:T、I :Α和I :G配对下的Quick T4连接酶作用均有较大的影响，相对而言，在连接位置旁边第5和4碱基位同时有2个替代时，对连接反应的影响最小。实施例4脱氧次黄嘌呤I掺入提高寡脱氧核苷酸链的有效连接长度5，Phos-TE 17 :5，pATCGAAGAGCTGAGGCG3，；BP23-6T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTTTT3，；
BP21-4T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATTTTT3，；BP23-5I-4I4T :5，CGCCTCAGCTCTTCGATIITTTT3‘SST30B6A :5，GTTCTAGAATCTTGATCACGCCTAAAAAAA3，；用pH8.0的TE缓冲液(IOmM三羟甲基胺基甲烷-盐酸"Tris-HCl，ImM乙二胺四乙酸EDTA)将以上寡核苷酸链均配制成浓度为ΙΟμΜ的溶液(用紫外分光光度计定浓度)，再配制以下4个反应组反应组1 :1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 5，Phos_TE17 加上 1 μ 1 浓度为 10 μ M 的 ΒΡ23-6Τ，再加上1 μ 1浓度为10 μ M的SST30B6A以及7 μ 1的TE缓冲液(ρΗ8. 0)；反应组2:同反应组1;反应组3 反应组1中ΒΡ23-6Τ用ΒΡ21-4Τ替代；反应组4 反应组1中ΒΡ23-6Τ用ΒΡ23_5Ι_4Ι4Τ替代；上述4个反应组的连接反应和电泳检测同实施例1 (反应组2中不加入Quick T4连接酶作为阴性对照)，结果见图5。如图5所示阴性对照(没有连接酶，也就是反应组2，即图5中1所示)没有连接产物；当寡核苷酸链有效连接配对由6个A:T配对(反应组1，即图5中2所示)缩减为4个A:T配对(反应组3，即图5中3所示泳道)时，连接产物浓度有很大下降；而当BP21-4T上重新掺入2个脱氧次黄嘌呤I，使得寡核苷酸链有效连接配对重新从4个碱基配对G个A:T配对，也就是反应组3，即图5中3所示泳道)增加到6个碱基配对O个A: I配对加4个A: T配对，也就是反应组4，即图5中4所示泳道)时，连接产物浓度有很大提高，与对照(反应组1，也就是没有脱氧次黄嘌呤I而全为自然碱基A:T配对，即图5中2所示泳道)相比，产物浓度变化不大，可见，脱氧次黄嘌呤I可以提高寡核苷酸链有效连接长度。实施例5连接时间对脱氧次黄嘌呤I掺入的I :A配对下连接反应的影响为考察连接时间对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即在连接位点旁边第3位点被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“_3”位I A配对)，Quick T4连接酶分别在室温(25°C )下连接0、5、30、300和900min，65°C处理15min终止连接反应后，电泳检测同实施例1，结果见图6。如图6所示连接5min (泳道2)后，连接反应基本已完成，继续延长连接反应，目的产物基本上没有进一步增加，甚至连接反应延长到900min (泳道幻后，产物浓度也基本不变。可见，Quick T4连接酶能在5min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I:A配对下的连接反应。实施例6连接酶量对脱氧次黄嘌呤I掺入的I :A配对下连接反应的影响为考察连接酶量对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即在连接位点旁边第3位被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“_3”位I A配对)，分别加入0、0. 5U、1U、2U和5U的Quick !"4连接酶，在室温(25°C )下连接5min，65°C处理15min终止连接反应后，电泳检测同实施例1，结果见图7。如图7所示没有加入连接酶(图7中1所示泳道)的反应没有形成目的产物，而加入0. 5U(2所示泳道)、1U(3所示泳道)、2U(4所示泳道)和5U(5所示泳道)的反应，均有较理想的连接产物，而且目的条带浓度基本不变。可见，0. 5U的QuickT4连接酶就能在25°C下5min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I :A配对下的连接反应。实施例7连接温度对脱氧次黄嘌呤I掺入的I A配对下连接反应的影响
为考察连接温度对脱氧次黄嘌呤I掺入下连接反应的影响，选用实施例1反应组13的条件(即在连接位点旁边第3位被脱氧次黄嘌呤I替代而形成“_3”位I A配对)，0. OT的 Quick T4 连接酶分别在 10°C、16°C、20°C、25°C和 30°C下连接 30min，65°C处理 15min 终止连接反应后，连接反应和电泳检测同实施例1，结果见图8。如图8所示在所考察的不同连接温度下，均有较理想的连接产物，而且目的条带浓度基本不变。可见，Quick T4连接酶就能在比较宽的温度范围内连接30min左右完成有脱氧次黄嘌呤I掺入的I :A配对下的连接反应。
权利要求
1.脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，其特征在于所述的应用为脱氧次黄嘌呤I作为通用碱基对脱氧寡核苷酸单链中的碱基进行单位点替代或多位点替代，并与被替代脱氧寡核苷酸单链的互补链进行碱基配对，形成脱氧寡核苷酸双链。
2.如权利要求1所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，其特征在于所述单位点替代为下列之一 (1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3个碱基位点或第3个碱基位点以上的位点替代腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G或胞嘧啶C ；(2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第2个碱基位替代鸟嘌呤G或胞嘧啶C ； (3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第1个碱基位替代鸟嘌呤G。
3.如权利要求1所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，其特征在于所述多位点替代为双位点替代，所述双位点替代为下列之一 1)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点处的第3和第4个碱基位替代胸腺嘧啶T ；2)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T ；3)脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第4和第5个碱基位替代胸腺嘧啶T、腺嘌呤A或胞嘧啶C中的一种。
4.如权利要求1所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，其特征在于所述多位点替代为三位点替代，所述三位点替代为脱氧次黄嘌呤I在脱氧寡核苷酸单链连接位点旁边的第3、第4和第5个碱基位替代鸟嘌呤G。
5.如权利要求1所述的脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，其特征在于所述应用按如下步骤进行(1)脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链连接位点第0 5位依次用脱氧次黄嘌呤进行单位点或多位点替代，并人工合成碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链；(2)连接反应将10 μ 1含终浓度均为1 μ M的三条不同的寡核苷酸单链的混合液，在95°C下处理5min后，以1°C /min的速率降温到10°C进行杂交，然后加入10 μ 1的连接液，在10 30°C下连接5 900min，紧接着在65°C下处理15min终止连接反应；(3)电泳检测然后用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳观察连接结果，所述连接液为下列物质的混合液66mM的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(pH7. 6) UOmM的氯化镁、ImM的二硫苏糖醇、7. 5%的PEG 6000、ImM ATP和1 IOU的Quick T4连接酶，所述三条不同的寡核苷酸单链为寡核苷酸单链、碱基位点被脱氧次黄嘌呤替代的寡核苷酸单链和与被替代的寡核苷酸单链互补的寡核苷酸单链。
全文摘要
本发明公开了一种脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用，所述的应用为脱氧次黄嘌呤I作为通用碱基对脱氧寡核苷酸单链中的碱基进行单位点替代或多位点替代，并与被替代脱氧寡核苷酸单链的互补链进行碱基配对，形成脱氧寡核苷酸双链；本发明提供了一种脱氧次黄嘌呤作为通用碱基在寡脱氧核苷酸链连接反应中应用的方法，本发明通过在寡脱氧核苷酸单链上进行单位点或多位点替代脱氧次黄嘌呤，从而提高寡脱氧核苷酸单链有效连接长度或降低寡脱氧核苷酸链文库大小，本发明所述的脱氧次黄嘌呤作为通用碱基相比于硝基吡咯等其他通用碱基，较易被公司合成，故具有经济、方便等优点。
文档编号C12N15/10GK102559667SQ201110459430
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者余志良, 张正波, 赵春田 申请人:浙江工业大学