展示抗体的方法

展示抗体的方法
【专利摘要】本方面公开了载体设计、构建和构建展示抗体的抗体库的方法，所述抗体例如全长免疫球蛋白、单链抗体(SCA)scFv、或Fab于寄主细胞表面的抗体。本发明也公开了为选择性的抗体目标而从上述抗体库中分离出想要的抗体结合者的筛选方法。
【专利说明】展示抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开提供载体的设计，构建和构建展示抗体，比如全长免疫球蛋白类，单链抗体（SCA) scFv，或Fab于寄主细胞表面的抗体库的方法。本发明也提供为选择性的抗体目标从上述的抗体库中分离想要的抗体结合者的筛选方法。
【背景技术】
[0002]抗体是有价值的，在各种分子生物学过程用作治疗剂和一般试剂。现有生产多克隆和单克隆抗体的方法，如许多抗体。许多基本文献描述标准的抗体生产过程，包括：Borrebaeck StJAntibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY, 1995 ；McCaffertyAntibody Engineering, A Practical Approach IRL at OxfordPress, Oxford, England, 1996 矛口 Paul (1995) StJ Antibody Engineering Pro toco IsHumana Press, Towata, NJ, 1995 ；Paul (ed.)的 Fundamental Immunology, RavenPress, N. Y, 1993; Coligan (1991) 该]Current Pro toco Is in Immunology ffiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Press, NY; Stites 等人(eds. ) Basic and Clinical Immunology (4th ed.)Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.,并在此引用作为参考；CodingMonoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed. ) Academic Press, NewYork, NY, 1986，以及 Kohler and Milstein 舱iare 256: 495-497，1975。
[0003]自然产生的抗体，或免疫球蛋白（Igs)，包括四条基本的多肽链结构，所述多肽链结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，所述重链和轻链通过链内和链间的二硫键稳定和横向连接。不同的抗体类型该四链结构的变异体，每条重链在其N端包括一个可变区域，其后有多个恒定区域。每条轻链在其N端具有一个可变区域并在其C端具有一个恒定区域。因为最大数量的序列变异集中在轻链和重链的N端区域；每个这些区域被称为可变(V)区域(或“V区”）。恒定区域组成恒定区，恒定区包括剩下的分子并呈现相对小的序列变化。重链包括五种主要的类型,取决于抗体的类型,并由大约450-600氨基酸残基组成。轻链有两种主要的类型并具有大约230个氨基酸残基。重链和轻链都折叠成区域，包括球状多肽区。
[0004]抗体通常包括两条大的重链和两条小的轻链。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链。它们由希腊字母表示：α，δ, ε, Υ和μ。目前重链的类型定义抗体的种类-IgA, IgD, IgE, IgG和IgM。每条重链包括恒定区和可变区。有两种类型的轻链-lambda(λ)和kappa (K)。每条轻链包括恒定区和可变区。所有相同的同种型抗体的恒定区是相同的。不同的B细胞产生的抗体的可变区不同，但单个B细胞产生的所有的抗体的可变区是相同的。
[0005] 抗体结合抗原的部分(抗原结合位点）包含在Fab (片段，抗原结合）区中。Fab区由（a)重链的恒定和可变区域，和（b)轻链恒定和可变区域组成，可变区域称为FV区。轻链可变区域缩写为VL。重链可变区域缩写为VH。[0006]抗体调节免疫细胞活性的部分被称为Fe (片段，結晶)区。Fe区由两条重链的恒定区组成。
[0007]在抗体中，轻链的可变区域与重链的可变区域对齐；轻链的恒定区域与重链的第ー恒定区域对齐。每对轻链和重链的可变区域形成抗原结合位点，抗原结合位点使抗体结合至抗原的表位。轻链和重链的恒定区域不直接參与抗原結合。每个重链或轻链可变区域包括四个相对保守的骨架(FR)区(或骨架片段)，骨架区通过3个高变区或互补决定区(CDRs)分开和连接。互补决定区被认为使抗体接触目标抗原并主要负责抗体与抗原的结
[0008]骨架区和CDRs 已经定义。(Kabat 等人，SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICALINTEREST, U.S.Dept.Health and Human Services, NationalInstitutes of Health, USA (5th ed.1991);和 Wu 等人，J.Ex0.Med.132:211-250(1970)，在此为了全部目的引用全文作为參考。对于可变区域的结构的其它讨论，參见Poljak 等人，Proc.Natl.Acad Sc1.USA, 70:3305-3310，1973; Segal 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 71:4298-4302，1974;和Marquart 等人，J.Mol.Biol., 141，369-391，1980，在此为了全部目的引用全文作为參考。同一物种内，不同的轻链或重链的骨架区的序列相对保守。结合的抗体的重链和轻链骨架区为适当地结合抗原提供空间并对齐 CDRs。
[0009]可变区域的CD Rs的氨基酸最初基于序列多变性而定义，由人重链可变区域(VH)的氨基酸残基31-35 (Hl)，50-65 (H2)以及95-102 (H3)和人轻链可变区域(VL)的氨基酸残基24-34 (LI), 50-56 (L2)以及89-97 (L3)组成，抗体的氨基酸残基使用Kabat编码系统。(Kabat 等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S.Dept.Health and Human Services, NIH, USA (5th ed.1991).Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917, 1987)展示了 CDRs的另ー种定义，该定义基于包含在可变区的三维结构环中的残基，这些残基在抗原结合活性方面是重要的。Chothia和Lesk定义⑶Rs为由人重链可变区域(VH)的氨基酸残基26-32 (HI), 53-55 (H2)以及96-101 (H3)和人轻链可变区域(VL)的氨基酸残基26-32 (LI), 50-52 (L2)以及91-96 (L3)组成。结合Kabat与Chothia和Lesk对Q)R的定义，基于Kabat编码系统，Q)Rs由人VH的氨基酸残基 26-35 (Hl), 50-65 (H2)和 95-102 (H3)和人 VL 的氨基酸残基 24-34 (LI), 50-56(L2)和 89-97 (L3)组成。
[0010]V基因编码V区域N端大约95个氨基酸。每个基因座中V基因的数目在基因座和物种之间变化，但可能包括大约多达几百个V基因。
[0011]抗体重链V区域包括V基因，D (多祥性)基因和J (结合)基因。抗体可变区域大的多祥性部分是源于V，D和J基因片段之间的重组。为了生产编码重链可变区域的基因，任何ー个重链可变区域的基因与小数目的D和J基因中的任何一个重组以生产VDJ基因。除了由于轻链可变区域没有D基因片段，V基因直接与J基因重组之外，轻链可变区域的重组过程是相似的。
[0012]就抗体库而言，一般来说，这些库已开始小鼠库的初歩筛选以在其重链和轻链可变区内找到具有理想的结合亲和力的小鼠抗体，也称为Fab区。但是，这种小鼠抗体对人的治疗没有用，因为服用鼠源抗体会导致寄主的免疫反应或排斥反应。[0013]美国专利5，869，619公开了一种降低抗体可变区域的免疫原性，同时保留抗体的配体结合特性的可能的过程，在该过程中人残基典型地代替小鼠可变区域残基，该小鼠可变区域残基被确定或预测为：（i)在与抗原的相互作用中，不具有重要的化学作用；以及
(ii)被定位为其侧链伸向溶剂中。因此，远离抗原结合位点的表面残基是人源的，而内部残基，抗原结合残基以及形成可变区域之间的连接的残基依然是小鼠的。这种方法的一个弊端是需要相当全面的实验数据以确定残基是否在抗原结合方面不具有重要的化学作用或在具体的三维抗体结构中位于溶剂中。
[0014]在美国专利5，225，539 (Winter I)中，被认为保守的小鼠可变区域肽序列的连续片段用人抗体的相应片段代替。在这个更常规的方法中，除了涉及抗原结合的非保守区外，可变区域残基被人源化。为了确定合适的用于替代的连续的片段，使用Wu和Kabat(1970)之前开发的抗体可变区域序列的分类法。
[0015]使用Kabat分类法的Winter I人源化方法获得嵌合抗体,嵌合抗体包括一个抗体的CDRs和另一个在种源，特异性，亚种或其它特性上不同的抗体的骨架区。但是，骨架区没有具体的序列或特性，Winter I教导任何一组骨架能与任何一组⑶Rs结合。骨架序列此后被认为对赋予抗体可变区的三维结构是重要的，该三维结构对于为保持好的抗原结合是必须的。因此，Winter I描述的常规的人源化方法具有频繁导致抗体灭活的弊端，因为这些参考文献不提供需要在许多可能的人骨架序列中理性选择的信息，那些人骨架序列很可能支撑来自非人源抗体的特定CDR区所需要的抗原结合 。
[0016]美国专利5,693,761 (Queen)公开了在Winter I基础上对人源化抗体的改良，并基于把亲和力降低归于人源化骨架中结构基序的问题，该问题在小鼠抗体发现，是由于空间或其它化学不相容，干扰CDRs折叠成能结合的构象。为了解决这个问题,Queen教导使用人骨架序列在线性肽序列上与将要人源化的鼠抗体的骨架序列密切同源。因此，Queen的方法重点在于比较物种间的骨架序列。通常，所有现有的人可变区域序列都与具体的鼠序列比对，并计算相应的骨架残基之间的百分比一致性。选择具有最高百分比的人可变区为人源化项目提供骨架序列。Queen也教导保留人源骨架是重要的，来自鼠源骨架的某些氨基酸残基对支撑CDRs能结合的构象是至关重要的。由分子模型评估潜在的重要性。保留的候选残基一般是那些在线性序列中邻近⑶R或物理上在任何⑶R残基6 A内的。
[0017]U.S.专利5，821，337和5，859，205公开了另一个分辨骨架序列的氨基酸的重要性的实施例方法。这些参考文献公开了骨架中具体的Kabate残基的位置，该残基在人源抗体中可能需要用相应的鼠源氨基酸代替以保持亲和力。Queen改良的一个弊端及其它是比对需要非常大量的人源骨架序列，和/或保留重要的氨基酸残基的准则不足以预测功能。因此，构建得到的，部分是人和部分是鼠的骨架依然频繁呈现出人免疫原性或较低的抗原结合活性，从而需要骨架构建的大量重复从而获得合适的骨架以作治疗之用。
[0018]人源抗体一般通过用人对应物替换对抗原特异性不重要的鼠抗体区制备。得到的人源抗体具有残留的鼠源序列，当人患者服用抗体时，残留的鼠源序列通常在患者体内诱导免疫反应(人抗-鼠反应)。因此，制备没有非人序列的全人抗体是受欢迎的。全人抗体已经有报道，通过如下方法获得，例如：用噬菌体展示技术构建和筛选的人抗体；通过将来自免疫的人供体的淋巴细胞移植到重度联合免疫缺陷（SCID)小鼠；或通过改造包含人免疫球基因的转基因小鼠（van Dijk等，2001)。但是，已经获得的这些全人库的多样性最多大约101°个。因此，本领域对达到更高多祥性的全人抗体展示库有強烈的要求。
[0019]针对病原体的全人抗体也已经通过大范围的脐带血筛选分离出来,全人抗体包含天然聚活性IgM谱(美国专利6，391，635)。但是，这些方法生产的抗体具有低的亲和力，或根据人供体具有预期的免疫反应。
[0020]已经开发各种不依赖于抗原注入动物内的抗体制备的重组技术。例如，可能在噬菌体或相似的载体中生成并选择重组抗体的库(Winter等人."Making Antibodies byPhage Display Technology" Ann.Rev.Tmmuno/.12:433-55，1994)。卩遼菌体抗体库也已经产生，通过链置换制备高亲和カ的人抗体(Marks等人，Biotechniques 10:779-782,1992)。
[0021]一般而言，库包括V基因谱(例如，从淋巴细胞群中获得或在体外组装)，克隆的V基因用于将相关的重链和轻链可变区域展示于丝状噬菌体的表面。通过结合至抗原选择噬菌体。感染细菌的噬菌体表达可溶的抗体并且该抗体能被改进，比如,通过诱变。
[0022]虽然已经建立了通过制备，筛选和纯化抗体生产抗体的方法，但是全面形成具有较高多祥性的人抗体库是受人欢迎的。
[0023]抗体通常包括两条大的重链和两条小的轻链。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链。它们由希腊字母表示:a，6, e, Y和y。目前重链的类型定义抗体的种类-1gA, IgD, IgE, IgG和IgM。每条重链包括恒定区和可变区。有两种类型的轻链-lambda(A)和kappa (K)。每条轻链包括恒定区和可变区。所有相同的同种型抗体的恒定区是相同的。不同的B细胞产生的抗体的可变区不同，但单个B细胞产生的所有的抗体的可变区是相同的。
[0024]抗体结合抗原的部分(抗原结合位点)包含在Fab (片段，抗原结合)区中。Fab区由(a)重链的恒定和可变区域，和(b)轻链恒定和可变区域组成，可变区域称为FV区。轻链可变区域缩写为VL。重链可变.区域缩写为VH。
[0025]抗体调节免疫细胞活性的部分被称为Fe (片段，結晶)区。Fe区由两条重链的恒定区组成。

【发明内容】

[0026]本发明提供ー种分离特异性结合抗原的免疫球蛋白功能部分的方法，包括(a)用编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列转化多个细胞；(b)分离用核酸序列转化的细胞以生成寄主细胞群；(c)用抗原接触寄主细胞群；(d)选择特异性结合抗原的寄主细胞；和(e)分离编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列。在一些实施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白的轻链，免疫球蛋白的重链，Fab区域，Fv区域，或它们的组合。在一些实施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白轻链的可变部分，免疫球蛋白轻链的恒定部分，免疫球蛋白重链的可变部分，免疫球蛋白重链的恒定部分或它们的组合。在一些实施例中，编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列进ー步包括跨膜区域序列。在一些实施例中，编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列包含在质粒内。在一些实施例中，该质粒进ー步包括哺乳动物附加体型复制起点，启动子，耐抗生素基因或它们的组合。在一些实施例中，寄主细胞是细菌细胞，酵母细胞，或哺乳动物细胞。在一些实施例中，抗原用荧光分子，接头分子或磁颗粒标记。在一些实施例中，通过进行磁分离或流式细胞分选选择与抗原相互作用的寄主细胞。[0027]在此，一些实施例公开了一种分离特异性结合抗原的免疫球蛋白的方法，包括（a)用用选自以下的核酸序列转化多个细胞，（i)编码免疫球蛋白重链的核酸序列；（ii)编码免疫球蛋白轻链的核酸序列；或（iii)编码免疫球蛋白重链的核酸序列和编码免疫球蛋白轻链的核酸序列；（b)分离用核酸序列转化的细胞以生成寄主细胞群；（c)用抗原接触寄主细胞群；（d)选择能特异性结合抗原的寄主细胞；（e)分离核酸序列。在一些实施例中，编码重链，轻链或两者的核酸序列进一步包括跨膜区域序列。在一些实施例中，编码重链的核酸序列和编码轻链的核酸序列包含在质粒内。在一些实施例中，编码重链的核酸序列包含在第一个质粒内，而编码轻链的核酸序列包含在第二个质粒内。在一些实施例中，质粒进一步包括哺乳动物附加体型复制起点，启动子，耐抗生素基因或它们的组合。在一些实施例中，寄主细胞是细菌细胞，酵母细胞，或哺乳动物细胞。在一些实施例中，抗原用荧光分子，接头分子或磁颗粒标记。在一些实施例中，通过进行磁分离或流式细胞分选选择与抗原相互作用的寄主细胞。
【专利附图】

【附图说明】
[0028]图I展示了 PlgH载体；
图2展示了 plgL载体；
图3展示了 plgH&L载体；
图4展示了 pscFv载体；
图5展示了 pFab载体；
图6展示了 plgHFab载体。
具体实施例
[0029]在此，一些实施例公开了一种分离免疫球蛋白功能部分的方法，包括（a)用编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列转化细胞以生成寄主细胞；（b)用抗原接触寄主细胞；（C)选择与抗原相互作用的寄主细胞；和（(1)分离编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列。在一些实施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白的轻链，免疫球蛋白的重链，或它们的组合。在一些实施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白轻链的可变部分，免疫球蛋白轻链的恒定部分，免疫球蛋白重链的可变部分，免疫球蛋白重链的恒定部分或它们的组合。
[0030]在此，某些实施例公开了一种分离抗体的方法，包括（a)用（i)编码免疫球蛋白重链的核酸序列jP(ii)编码免疫球蛋白轻链的核酸序列转化细胞以生成寄主细胞；（b)用抗原接触寄主细胞；（c)选择与抗原相互作用的寄主细胞；（d)分离编码重链和轻链的核酸序列。
[0031]在此，某些实施例进一步公开新的载体设计，构建和构建展示抗体，比如全长免疫球蛋白类，单链抗体（SCA), scFv,或Fab于寄主细胞表面的抗体库的方法。
[0032]定义
当涉及结合分子（即试剂，例如肽或模拟肽）和蛋白或多肽或表位之间的相互作用时，短语“特异性结合”通常指结合分子识别并可检测地以高亲和力特异性结合至感兴趣的目标。优选地，在指定的或生理条件下，特定的抗体或结合分子结合至特定的多肽，蛋白或表位，但不以重要的或不想要的数量结合至存在于样品中的其它分子。换句话说特定的抗体或结合分子不会不受欢迎地与非目标抗原和/或表位交叉反应。使用各种免疫測定方式以选择与特定的多肽免疫反应并具有想要的特异性的抗体或其它结合分子。例如。使用固相ELISA免疫測定，BIAcore，流式细胞仪和放射性免疫測定以选择具有想要的免疫反应性和特异性的单克隆抗体。參见 Harlow, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Publications, New York (下文为 “Harlow”)，该文描述了用于确定或估计免疫反应性和特异性的免疫測定方式或条件。
[0033]“选择性结合” “选择性”及类似词汇是指相比另ー个分子，试剂优选与ー个分子相互作用。优选地，在此公开的试剂和蛋白之间的相互作用都是特异的和有选择性的。注意，在一些实施例中，试剂设计成“特异性结合”和“选择性结合”两种区别，但其结合相似的目标而没有结合其它不想要的目标。
[0034]术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在此可交換地使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然生成的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然生成的氨基酸的氨基酸聚合物(例如氨基酸类似物)。该术语包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中，氨基酸残基通过共价肽键连接。
[0035]术语“基序”或“区域”可交換使用。在此使用该术语表示折叠不依赖于剩下的多肽并具有它自己的功能的，离散的、连续或不连续的多肽部分。
[0036]术语“破坏”(disruption)表示干扰功能。例如，破坏基序或区域表示干扰基序/区域的功能。
[0037]术语“抗原”是指能诱导抗体产生的物质。在一些实施例中，抗原是能特异性结合至抗体可变区的物质。
[0038]术语“抗体”是指单克隆抗体，多克隆抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，移植抗体，人抗体，人源抗体，合成 抗体，嵌合抗体，骆骑化的抗体，单链Fvs (scFv),单链抗体,Fab片段，F(ab/ )片段,二硫连接Fvs (sdFv),细胞内抗体,和抗独特型(ant1-1d)抗体以及上述任何抗原结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。根据其重链的恒定基序/区域的氨基酸序列，免疫球蛋白类可分为不同的类。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定基序/区域(Fe)分别被称为a，6 , e , Y和ii。不同类的免疫球蛋白的二级结构和三维构象是已知的。免疫球蛋白分子分为任何型(例如IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)，类(例如IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA1和IgA2)或亚类。广义上，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可交換使用。在ー些实施例中，抗体是大分子的一部分，通过抗体与一个或多个其它蛋白或肽的共价或非共价结合而形成。
[0039]载体，细胞和库
在一个实施例中，载体命名为PlgH (图1)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点(比如SV40 ori)，用于抗生素(例如新霉素基因NeoR)选择的耐抗生素标记和质粒复制起点。PlgH也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子(例如CMV启动子)，该启动子启动下游全长免疫球蛋白重链基因的表达。PlgH包括重链恒定区(CH)序列，在该序列的C末端，跨膜(TM)序列(例如TOGFR beta跨膜结构区域)构建于该表达载体内，跨膜(TM)序列固定表达的免疫球蛋白重链于哺乳动物寄主细胞表面。免疫球蛋白基因的重链可变区域序列(VH)或VH基因库插入片段能重组地插入到plgH载体设定的插入位点。所述载体可选择地包括酶切位点（比如凝血酶位点)，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基(或“消耗培养基”，spent media)中。
[0040]在另一个实施例中，载体命名为plgL (图2)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点（比如SV40 ori)，用于抗生素(例如新霉素基因NeoR)选择的耐抗生素标记和质粒复制起点。PlgL也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子（例如CMV启动子），该启动子启动下游全长免疫球蛋白重链基因的表达。PlgL包括轻链可变区域和恒定区（CL)序列。
[0041]在一个实施例中，重链的可变区域库（VH库）插入到图一的plgH载体中以生成FL免疫球蛋白重链库（IgH库）。
[0042]在另一个实施例中，选定的重链的单条可变区域序列（sVH)插入到图一的plgH载体以生成单个FL免疫球蛋白重链（slgH)。
[0043]在一个实施例中，FL轻链库插入到图二的PI gL载体以生成FL免疫球蛋白轻链库(IgL 库)ο
[0044]在另一个实施例中，单条选定的FL轻链插入到图二的plgH载体以生成单条FL免疫球蛋白轻链（SlgL)。
[0045]在优选的实施例中，FL IgH库和FL IgL库共同转染到哺乳动物细胞培养物中，并且FL IgH和FL IgL基因在单独的共同转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可表达成百（102)到数十万（105)通过TM区域固定于细胞表面的全组合FL免疫球蛋白。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在地表达和展示IO8到IO15个全长组合FL免疫球蛋白于细胞表面。
[0046]在另一个优选的实施例中，FL IgH库和FL IgL库共转染到哺乳动物细胞培养物中，并且FL IgH和FL IgL基因在单独的共转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可能表达成百到数十万全组合FL免疫球蛋白，全组合FL免疫球蛋白通过TM区域固定于细胞表面。每个哺乳动物细胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括单条普通的FL轻链（SlgL)和不同的FL IgH链，FL轻链（slgL)和FL IgH链在表面固定全组合免疫球蛋白。每个单独的细胞可表达成百到数十万全组合FL免疫球蛋白，全组合FL免疫球蛋白包括单条普通的slgL的FL轻链和不同的FL IgH，通过TM区域固定于细胞表面的。IO6到101°个细胞的细胞培养物潜在表达和展示IO8到IO15全组合FL免疫球蛋白于细胞表面，所有的FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0047]在另一个优选的实施例中，FL SlgH库和FL IgL库共转染到哺乳动物细胞培养物中，并且FL slgH和FL IgL基因在单独的共同转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可表达成百到数十万通过TM区域锚定于细胞表面的全组合FL免疫球蛋白。每个哺乳动物细胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括单个普通的FL重链（slgH)和不同的FL IgL链，FL重链（slgH)和FL IgL链在表面固定全组合免疫球蛋白。每个单独的细胞能表达成百（102)到数十万（105)个全组合FL免疫球蛋白，全组合FL免疫球蛋白包括单条普通的slgH的FL重链和不同的FL IgL，通过TM区域固定在细胞表面。IO6到101°个细胞的细胞培养物潜在表达和展示IO8到IO15个全长组合FL免疫球蛋白于细胞表面，所有的FL免疫球蛋白都包括slgH。
[0048]在一个优选的实施例中，单个FL重链免疫球蛋白（slgH)或FL重链免疫球蛋白库(IgH库)转染到哺乳动物细胞。当新霉素抗性基因表达时，通过抗生素选择(例如G418药物选择)，使转染的哺乳动物细胞变得稳定。表达ー个或多个IgH的稳定的哺乳动物细胞在此称为IgH表达系。
[0049]在另ー个优选的实施例中，单个FL轻链免疫球蛋白(SlgL)或FL轻链免疫球蛋白库(IgL库)转染到哺乳动物细胞。当新霉素抗性基因表达时，通过抗生素选择(例如G418药物选择)使转染的哺乳动物细胞变得稳定。表达一条或多条IgL的稳定的哺乳动物细胞在此称为IgL表达系。
[0050]在一个优选的实施例中，IgH库转染到IgL表达系，使得IgL表达系的转染细胞在转染的IgL表达系细胞中表达全组合免疫球蛋白，每个全组合免疫球蛋白包括成百(102)至数十万(105) IgHs和单条IgL。IO6到101°个细胞的细胞培养物可在细胞表面产生IO8到IO15不同的全组合FL免疫球蛋白，这些转染细胞进行进一歩的抗原生物淘选和结合选择。
[0051]在另ー个优选的实施例中，IgL库转染到IgH表达系，使得IgH表达系的转染细胞在转染后的IgH表达系细胞中表达全组合免疫球蛋白，每个全组合免疫球蛋白包括成百
(102)至数十万(105) IgLs和单条IgH。IO6到101°个细胞的细胞培养物可在细胞表面产生IO8到IO15个不同的全组合FL免疫球蛋白，这些转染细胞进行进一歩的抗原生物淘选和结合选择。
[0052]在一个实施例中，不同骨架的(例如其包括不同耐抗生素基因)PlgH和plgL载体用于构建全长重链和轻链免疫球蛋白库两者。通过将PlgH和plgL结构转化到原核细胞中，和以质粒的形式包括免疫球蛋白重链或轻链基因的分离的载体，初步构建重链和轻链免疫球蛋白库。PlgH和plgL共转染到哺乳动物细胞以在每个单独的哺乳动物细胞中共表达多个不同型的重链和轻链。筛选并选择表达多个恰当构建并组合免疫球蛋白的细胞从而适当地结合选定的目标抗原，从细胞中游离地或胞质地回收选择的表达免疫球蛋白的载体的亚群，用于进一歩的分析和选择.过程。如果PlgH和plgL使用两种不同的抗生素药物抗性选择标记基因，通过不同的抗生素选择能简单地分离PlgH和plgL质粒。
[0053]在一个实施例中，载体命名为plgH&L (图3)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点(比如SV40 ori)，用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如新霉素基因NeoR)和质粒复制起点。plgH&L也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子(例如CMV启动子)，该启动子启动下游全长免疫球蛋白重链基因的共表达。通过在FL H和L链之间连接的内部核糖体进入位点(IRES)实现重链和轻链的共表达。FL H链在其c末端包括TM序列，用于固定FL免疫球蛋白H链于哺乳动物细胞表面。所述载体可选择地包括酶切位点(比如凝血酶位点)，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基中。
[0054]在一个优选的实施例中，重链可变区域序列的库插入到plgH&L的VH插入位点形成IgH库，而单条普通的FL轻链插入到载体plgH&L中，转染到哺乳动物细胞培养物后在单独的转染的哺乳动物细胞中共表达FL IgH库和单个普通的FL SlgL基因并展示于细胞表面。每个单独的细胞可表达成百(102)到数十万(105)通过TM区域固定于细胞表面的全组合FL免疫球蛋白。每个哺乳动物细胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括单条普通的FL轻链(slgL)和不同的FL IgH链，FL轻链(SlgL)和FL IgH在表面固定全组合免疫球蛋白。IO6到101°个细胞的细胞培养物潜在表达并展示IO8到IO15个全组合FL免疫球蛋白于细胞表面，所有的全组合FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0055]在另一个优选的实施例中,FL轻链库插入到plgH&L的轻链插入位点形成IgL库，而单条普通的FL重链插入载体plgH&L中，转染到哺乳动物细胞培养物后在单个转染的哺乳动物细胞中共表达FL IgL库和单条普通的FL slgH基因并展示于细胞表面。每个单独的细胞可表达成百（102)到数十万（105)通过TM区域固定于细胞表面的全组合FL免疫球蛋白。每个哺乳动物细胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括单条普通的FL重链（slgH)和不同的FL IgL链，FL重链（slgH)和FL IgL链在表面固定全组合免疫球蛋白。IO6到101°个细胞的细胞培养物潜在表达和展示IO8到1015个全组合FL免疫球蛋白于细胞表面，所有的全组合FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0056]在一个实施例中，载体命名为pscFv (图4)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点（比如SV40 ori)，用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如新霉素基因NeoR)和质粒复制起点。PscFv也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子（例如CMV启动子），该启动子启动下游单链抗体（SCA)以scFv的形式表达,scFv通过重链可变区域（VH)和轻链可变区域以肽键连接形成。scFv序列在其c末端包括TM序列,用于将scFv固定到哺乳动物细胞表面。所述载体可选择地包括酶切位点（比如凝血酶位点）或标签肽（例如c-myctag)，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基，该标签肽用于标签肽检测。在一个实施例中，VH插入片段为VH区域序列库（VH库)，而VL插入片段为单条VL序列（sVL)，包括VH库和sVL的库转染细胞培养物以表达scFv库并通过TM固定展示于细胞表面。包括成百（102)至数亿（108)的VH插入片段的VH库和普通的sVL的库转染细胞培养物，每个单独的细胞表达并展示成百（102)至数十万（105)不同的scFv，scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段为VL区域序列库（VL库)，而VH插入片段为单条VH序列（sVH)，包括VL库和sVH的库转染细胞培养物以表达scFv库并通过TM固定展示于细胞表面。包括成百（102)至数亿（IO8)VL插入片段的VL库和普通的sVH的库转染细胞培养物，每个单独的细胞表达并展示成百（102)至数十万（105)不同的scFv，scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0057]在一个实施例中，pscFv载体为噬菌体展示载体，其包括用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如氨节青霉素基因AmpR),质粒复制起点。pscFv也包括用于在疋co7i细胞中启动基因表达的启动子，该启动子驱动下游scFv基因的表达，VH-肽接头-VL的scFv与噬菌体外壳蛋白比如pIII，pVII，pVIII，或pIX有效地连接，从而通过将外壳蛋白连接至噬菌体颗粒表面实现scFv展示。包括成百（102)至数亿（IO8)VH插入片段的VH库和普通的sVL的库转化到万.co7i细胞培养物,每个单独的万.co7i细胞表达并展示单条scFv, scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段为VL区域序列库（VL库)，而VH插入片段为单条VH序列（sVH)，包括VL库和sVH的库转化到E. coli细胞培养物中以表达scFv库并通过融合噬菌体外壳蛋白展示于噬菌体颗粒上。包括成百（102)至数亿（IO8)VL插入片段的VL库和普通的sVH的库转化到E. coli细胞培养物中，每个单独的E. coli细胞表达并展示单条scFv, scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0058]在另一个实施例中，pscFv载体为酵母展示载体，该载体包括用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如氨节青霉素基因AmpR),质粒复制起点。pscFv也包括用于在疋coli细胞中启动基因表达的启动子，该启动子启动下游scFv基因的表达，VH-肽接头-VL的scFv与酵母表面蛋白有效地连接，从而通过将酵母表面蛋白连接至酵母细胞表面实现scFv展示。包括成百(102)至成数亿(IO8)VH插入片段的VH库和普通的sVL的库转化到酵母细胞培养物中，姆个单独的酵母细胞表达并展示单条scFv, scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段为VL区域序列库(VL库)，而VH插入片段为单条VH序列(sVH)，包括VL库和sVH的库转化到酵母细胞培养物中以表达scFv库并通过融合酵母表面蛋白展示于酵母表面。包括成百(102)至数亿(IO8)VL插入片段的VL库和普通的sVH的库转化到酵母细胞培养物中，姆个单独的酵母细胞表达并展示单条scFv, scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0059]在一个实施例中，载体命名为pFab (图5)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点(比如SV40 ori)，用于抗生素选择的耐抗生素标记和质粒复制起点(例如新霉素基因NeoR)。pFab也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子(例如CMV启动子)，该启动子启动下游Fab基因的表达，VL-CL的Fab，VH-CHl和FL轻链通过VH-CHl和VL-CL之间连接的内部核糖体进入位点实现共表达。VH-CHl链或VL-CL轻链在其相应的c末端包括TM序列，用于将Fab固定于哺乳动物细胞表面。所述pFab载体可选择地包括酶切位点(比如凝血酶位点)或蛋白标签位点，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基中，蛋白标签位点用于蛋白标签的检测。
[0060]在一个优选的实施例中，VH-CHl插入片段库和VL-CL插入片段库插入到pFab载体中并转染到哺乳动物细胞培养物中。VH-CHl和VL-CL基因在単独的共转染的哺乳动物细胞中共表达，并且Fab在细胞表面组装和展示。每个单独的细胞可能表达成百(102)至数十万(105)全组合Fab，全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。IO6到101°个细胞的细胞培养物潜在表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面。
[0061 ] 在另ー个实施例中，VH-CHl插入片段库和单条VL-CL插入片段插入到pFab载体并转染到哺乳动物细胞培养物中。VH-CHl基因和单条VL-CL基因在単独的共转染的哺乳动物细胞中共表达，并且Fab在细胞表面组装和展示。每个单独的细胞可能表达成百(102)至数十万(105)全组合Fab,姆条全组合Fab包括不同的VH-CHl和普通的VL-CL插入片段,全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在地表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面，每个全组合Fab包括不同的VH-CHl和普通的VL-CL。
[0062]在另ー个优选的实施例中，单条VH-CHl插入片段和VL-CL插入片段库插入到pFab载体并转染到哺乳动物细胞培养物。单个普通的VH-CHl基因和VL-CL基因在単独的共转染的哺乳动物细胞中共表达，并且Fab在细胞表面组装和展示。每个单独的细胞可能表达成百(102)至数十万(105)全组合Fab，每条全组合Fab包括单条普通的VH-CHl片段和不同的VL-CL插入片段，全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在地表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面，每个全组合Fab包括普通的VH-CHl和不同的VL-CL片段。
[0063] 在另ー个实施例中，图5的pFab载体为卩遼菌体展不载体,该载体包括用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如氨苄青霉素基因AmpR)，质粒复制起点。pscFv也包括用于在E.coli细胞中启动基因表达的启动子，该启动子启动下游Fab基因的表达，VL-CL的Fab，VH-CHl和FL轻链通过VH-CHl和VL-CL之间连接的内部核糖体进入位点(IRES)实现共表达。VH-CHl和VL-CL的Fab与噬菌体外壳蛋白比如pIII，pVII，pVIII，或pIX有效地连接，从而通过将外壳蛋白连接至噬菌体颗粒表面实现Fab的展示。包括成百(102)至数亿(108)的VH-CHl插入片段的VH-CHl库和单条普通的FL轻链sVL_CL的库转化疋coli细胞培养物，每个单独的疋coli细胞表达并展示单条Fab，Fab包括不同的VH-CHl和普通的sVL-CL。反之，FL VL-CL插入片段为FL VL-CL轻链序列库（VL库)，而VH插入片段为单条VH-CHl序列（sVH-CHl)，包括VL-CL库和sVH_CHl的库转化疋coli细胞培养物从而表达Fab库，并通过融合噬菌体外壳蛋白在噬菌体颗粒上展示。包括成百（102)至成数亿（108)VL-CL插入片段的VL-CL库和普通的sVH-CHl的库转化疋coli细胞培养基，每个单独的E. coli细胞表达并展示单条Fab，Fab包括不同的VL-CL和普通的sVH-CHl。
[0064]在另一个实施例中，pFab载体为酵母展示载体，该载体包括用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如氨苄青霉素基因AmpR)，质粒复制起点。pFab也包括用于在酵母细胞中启动基因表达的启动子，该启动子启动下游Fab基因的表达，VH-CHl和VL-CL的Fab通过VH-CHl或VL-CL与酵母表面蛋白有效地连接，从而通过将酵母表面蛋白连接至酵母细胞表面实现Fab展示。包括成百（102)至数亿（108) VH-CHl插入片段的VH-CHl库和普通的sVL-CL的库转化到酵母细胞培养物中，每个单独的酵母细胞表达并展示单个Fab，Fab包括不同的VH-CHl和普通的sVL-CL。反之，VL-CL插入片段为FL VL-CL轻链序列库（VL-CL库)，而VH插入片段为单条VH-CHl序列（sVH-CHl),包括VL-CL库和sVH-CHl的库转化到酵母细胞培养物中以表达Fab库并通过融合酵母表面蛋白展示于酵母表面。包括成百（102)至数亿（108) VL-CL插入片段的VL库和普通的sVH-CHl的库转化到酵母细胞培养物中，每个单独的酵母细胞表达并展示单条Fab，Fab包括不同的VL-C和普通的sVH_CHl。
[0065]在一个实施例中，载体命名为pVH-CHl (图6)，该载体包括哺乳动物附加型复制起点（比如SV40 ori),用于抗生素选择的耐抗生素标记(例如新霉素基因NeoR)和质粒复制起点。PVH-CHl也包括用于在哺乳动物细胞中启动基因表达的启动子（例如CMV启动子），该启动子启动下游VH-CHl基因的表达。VH-CHl在其相应的c末端可能选择性地包括TM序列，用于固定VH-CHl至哺乳动物细胞表面。所述pVH-CHl载体可选择地包括酶切位点(比如凝血酶位点）或蛋白标签位点，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基中，蛋白标签位点用于蛋白标签的检测。
[0066]在另一个实施例中，命名为图2的plgL的载体包括VL-CL插入片段，该插入片段可能在其c末端可选择地包括TM序列，用于固定FL VL-CL至哺乳动物细胞表面。所述PVL-CL载体可选择地包括酶切位点（比如凝血酶位点）或蛋白标签位点，该酶切位点用于蛋白酶剪切以释放固定的抗体至废弃培养基中，蛋白标签位点用于蛋白标签的检测。
[0067]在一个实施例中，VH-CHl插入片段库插入到图6的pVH_CHl载体中以生成pVH-CHl 库（pVH-CHl 库)。
[0068]在另一个实施例中，单条VH-CHl (sVH-CHl)插入片段插入到图6的pVH-CHI载体以生成单条普通的pVH-CHl (sVH-CHl)。
[0069]在一个优选的实施例中，pVH-CHl库和FL IgL库共转染到哺乳动物细胞培养物中，并且VH-CHl和FL IgL基因在单独的共转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可能表达成百（102)至数十万（105)全组合Fab，全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在地表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面。
[0070]在另一个优选的实施例中，pVH-CHl库和FL slgL转染到哺乳动物细胞培养物中，并且VH-CHl和FL slgL基因在单独的共转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可能表达成百至数十万全组合Fab，全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。每个哺乳动物细胞中所有的Fab可能包括单条普通的FL轻链（slgL)和不同的VH-CH1，FL轻链（slgL)和VH-CHl固定全组合Fab于表面上。每个单独的细胞可能表达成百(102)至数十万（105)全组合Fab，Fab包括单条普通的slgL的FL轻链和不同的VH-CHl重链片段，通过TM区域固定在细胞表面。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面，所有的全组合Fab包括slgL。
[0071]在另一个优选的实施例中，单条普通的sVH-CHl和FL IgL库转染到哺乳动物细胞培养物中，并且sVH-CHl片段和FL IgL基因在单独的共转染的哺乳动物细胞中共表达并展示于细胞表面。每个单独的细胞可能表达成百至数十万全组合Fab，全组合Fab通过TM区域固定在细胞表面。每个哺乳动物细胞中所有的Fab可能包括单条普通的VH-CHl (sVH-CHl)和不同的FL IgL链，VH-CHl (sVH-CHl)和FL IgL链固定全组合Fab在表面上。每个单独的细胞可能表达成百（102)至数十万（105)全组合Fab，Fab包括单个普通的VH-CHl和不同的FL IgL，通过TM区域固定在细胞表面。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物潜在地表达并展示IO8到IO15全组合Fab于细胞表面，所有的全组合Fab包括sVH_CHl。
[0072]在一个优选的实施例中，单条sVH-CHl或pVH-CHl库（pVH-CHI库）转染到哺乳动物细胞中。当新霉素抗性基因表达时，通过抗生素选择(例如G418药物选择)使转染的哺乳动物细胞变得稳定。表达一个或多个VH-CHl的稳定的哺乳动物细胞在此被称为VH-CHl表达系。
[0073]在一个优选的实施例中，pVH-CHl库转染到IgL表达系中，使得IgL表达系的转染细胞表达全组合Fab转染IgL表达系细胞，每个全组合Fab转染IgL表达系细胞包括成百
(102)至数十万（105) VH-CHl插入片段和单条IgL。IO6到101°个细胞的细胞培养物可在细胞表面产生IO8到IO15不同 的全组合Fab，针这些转染细胞进行进一步的抗原生物淘选和结合选择为预定的抗原选择Fab。
[0074]在另一个优选的实施例中，IgL库转染到VH-CHl表达系中，使得VH-CHl表达系的转染细胞表达全组合Fab转染VH-CHl表达系细胞，每个全组合Fab转染VH-CHl表达系细胞包括成百（102)至数十万（105) IgLs和单条VH-CHl片段。IO6到IOltl个细胞的细胞培养物可在细胞表面产生IO8到IO15不同的全组合Fab，这些转染细胞进行进一步的抗原生物淘选和结合选择为预定的抗原选择Fab。
[0075]在一个实施例中，不同骨架(例如其包括不同的耐抗生素基因）的pVH-CHl和plgL载体用于构建VH-CHl重链片段和FL轻链免疫球蛋白库两者。通过将pVH-CHl和plgL结构转化到原核细胞中，和以质粒的形式包括重链片段或全长轻链免疫球蛋白基因的分离的载体，初步构建VH-CHl和轻链免疫球蛋白库。pVH-CHl和plgL共转染到哺乳动物细胞以在每个单独的哺乳动物细胞中共表达多条不同型的VH-CHl重链片段和FL轻链。筛选并选择表达多个适合地构建和组装Fab的细胞从而适当地结合选定的目标抗原。从细胞中游离地或胞质地回收选定的表达Fab的载体的亚群,用于进一步的分析和选择过程。如果pVH-CHl和PlgL使用两种不同的抗生素药物抗性选择标记基因，通过不同的抗生素选择能简单地分离pVH-CHl和plgL质粒。
[0076]通过在寄主细胞中抗体和预定抗原的特异性结合选择能实现上述针对预定抗原的不同型的抗体库(FL IgGl, scFv或Fab库)的生物淘选。
[0077]在一个实施例中，寄主细胞为万.cWi，其中抗体库在噬菌体展示载体中。选择表达结合者抗体(FL IgGl, scFv或Fab抗体)的万.cWi细胞并回收包含在寄主万.coli细胞内的噬菌体颗粒。该生物淘选过程可重复，从而进ー步丰富表达想要的结合者抗体的噬菌体颗粒。
[0078]在另ー个优选的实施例中，寄主细胞为酵母细胞，其中抗体库中的抗体展示于酵母细胞表面。预定的抗原通过荧光标记并与包括表达抗体库的酵母细胞一起培养。通过流式细胞分选(FACS)选择与荧光标记的抗原结合的酵母细胞。细胞分选选择过程可重复，从而在酵母抗体库中进一步丰富包含想要的结合者抗体的酵母细胞。
[0079]在另ー个优选的实施例中，寄主细胞为哺乳动物细胞，其中抗体库中的抗体展示于乳动物细胞表面。预定的抗原通过荧光标记并与包括表达抗体库的哺乳动物细胞一起培养。通过流式细胞分选(FACS)选择与突光标记的原结合的哺乳动物细胞。细胞分选选择过程可重复，从而从哺乳动物抗体库中进一步丰富包含想要的结合者抗体的哺乳动物细胞。
[0080]在一个实施例中。预定的抗原共价连接磁颗粒。连接预定抗原的磁颗粒与寄主细胞一起培养，比如表达抗体库的^: cWi，酵母或哺乳动物细胞。包括结合者抗体的细胞与包括非结合者抗体的细胞分离，并且想要的抗体和它们相应的基因序列分离。采用磁颗粒的生物淘选过程能重复，从而进 ー步丰富包含想要的结合者抗体的寄主细胞。
【权利要求】
1.一种分离特异性结合至抗原的免疫球蛋白功能部分的方法，包括： Ca)用编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列转化细胞； (b)分离用编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列转化的细胞，从而生成寄主细胞群； (c)用抗原接触寄主细胞； Cd)选择特异性结合抗原的寄主细胞；并且 (e)分离编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白功能部分为免疫球蛋白的轻链，免疫球蛋白的重链，Fab区域，Fv区域或它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白功能部分为免疫球蛋白轻链的可变部分，免疫球蛋白轻链的恒定部分，免疫球蛋白重链的可变部分，免疫球蛋白重链的恒定部分或它们的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列进一步包括跨膜区域序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码免疫球蛋白功能部分的核酸序列包含在质粒内。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质粒进一步包括哺乳动物附加型复制起点，启动子，耐抗生素基因，或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞为细菌细胞，酵母细胞或哺乳动物细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原用荧光分子，接头分子或磁颗粒T 己 O
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过磁分离或流式细胞分选选择与抗原相互作用的寄主细胞。
10.一种分离特异性结合至抗原的免疫球蛋白的方法，包括： (a)用选自以下的核酸序列转化多个细胞： i.编码免疫球蛋白重链的核酸序列； ?.编码免疫球蛋白轻链的核酸序列；或 iii.编码免疫球蛋白重链的核酸序列和编码免疫球蛋白轻链的核酸序列； (b)分离用核酸序列转化的细胞，从而生成寄主细胞群； (c)用抗原接触寄主细胞群； (d)选择特异性结合抗原的寄主细胞；并且 (e)分离核酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为功能性抗体。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为单链抗体（SCA)。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为scFv。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述编码重链，轻链或两者的核酸序列进一步包括跨膜区域序列。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述编码重链的核酸序列和编码轻链的核酸序列包含在质粒内。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述编码重链的核酸序列包含在第一个质粒内，而所述编码轻链的核酸序列包含在第二个质粒内。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述质粒进ー步包括哺乳动物附加型复制起点、启动子、耐抗生素基因、或它们的组合。
18.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述寄主细胞为细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
19.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗原用荧光分子、接头分子或磁颗粒标记。
20.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过磁分离或流式细胞分选选择与抗原相互作用的 寄主细胞。
【文档编号】C12P21/00GK103476941SQ201180018943
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2011年4月12日 优先权日:2010年4月12日
【发明者】亨利·吉, 周和悦, 张彦良, 查尔斯·罗迪 申请人:索伦托治疗有限公司