专利名称：用于脆性x染色体综合征(fxs)治疗的预测标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种个体化治疗方法。具体说，本发明涉及预测患有脆性X染色体综合征的个体是否将对用特定治疗剂治疗作出临床反应。
背景技术：
脆性X染色体综合征(FXS)为遗传型智力低下的最常见病因，其在世界范围的发病率为男性1/4000及女性1/8000。FXS的发病率比其他与X染色体有关的智力低下高10至20倍。FXS为单基因疾病，且主要由引发脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因的过度甲基化及沉默的CGG重复序列扩增所致。不存在FMRl蛋白(FMRP)可能造成代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)信号传导所介导的蛋白质合成刺激过度且因此导致FXS表型多样性。mGluR5拮抗剂可能降低mGluR5信号传导并校正由缺乏脆性X染色体智力低下蛋白所致的缺陷。
对于FXS无特效疗法且临床实践因不同国家而各异。用于治疗FXS症状的最常见药物为刺激剂(亦即哌醋甲酯(methylphenidate))、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)(例如氟西汀(fluoxetine))、a -肾上腺素受体促效剂(例如可乐定(clonidine))、情绪稳定剂(例如卡马西平(carbamazepine))及抗精神病药(例如利培酮(risperidone)、奥氮平(olazapine))。此等药物皆因其功效有限且可能存在不良副作用而放弃使用。近年来，亦已表明mGluR拮抗剂的作用。日益增加的证据表明，患者的遗传概况可决定患者对治疗剂治疗的反应性。假定许多疗法可用于患有FXS的个体，可测定影响例如对特定药物的反应的遗传因子以便向患者提供个体化治疗方案。该等个体化治疗方案可能使对患者的治疗效益最大，同时将可能与替代性治疗方案有关的相关副作用减至最少。因而，需要鉴别可用于预测患者是否有可能对特定疗法作出反应的因素。
发明内容
本发明基于发现可使用特定生物标记来选择可能对mGluR5拮抗剂治疗作出反应的患有FXS的个体。具体说，已发现，来自患有FXS的个体的样品中与对照相比的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化状态及/或FMRl基因表达量降低及/或FMRl蛋白(FMRP)的量降低可用于预测该个体是否将对mGluR5治疗作出反应。因而，本发明允许治疗提供者在给予mGluR5拮抗剂之前鉴别对mGluR5治疗作出反应的患有FXS的个体及对该治疗无反应的患有FXS的个体。在一个方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法。该方法包括提供来自患有脆性X染色体综合征的个体的核酸样品；测定该样品中脆性X染色体智力低下I (FMRl)基因区的甲基化程度；及若该样品中所存在的所有或基本上所有FMRl基因区已甲基化，则将该个体归为mGluR5反应者。FMRl启动子的甲基化程度可藉由本领域中已知的任何方法来测定，包括选自以下检测甲基化敏感性限制酶消化组合Southern印迹法或定量PCR (基于探针或SYBR绿)中的至少一者；或亚硫酸氢盐DNA修饰组合甲基化特异性PCR(MSP)、定量甲基化特异性PCR (基于探针或SYBR绿)或焦磷酸测序中的至少一者。在一实例中，甲基化程度使用定性检测如MSP来测定，且若仅检测到甲基化的相关FMRl基因区，亦即在相关FMRl基因区中未检测到未甲基化FMRl，则将个体鉴别为mGluR5反应者。在另一实例中，甲基化程度使用定量检测来测定，且若FMRl基因区的甲基化程度测定为99. 5%或99. 5%以上，则将个体鉴别为mGluR5反应者。定量检测的一个实例为甲基化敏感性限制酶消化组合qPCR。在另一方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括提供来自患有FXS的个体的核酸样品；测定该样品中的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化程度，其中若该样品中所存在的所有或基本上所有FMRl基因区已甲基化，则将该个体鉴别为mGluR5反应者；及向鉴别为mGluR5反应者的个体给予mGluR5拮抗剂。在又一方面，本发明包括一种用于测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括提供来自患有FXS的个体的核酸样品；及使用甲基化敏感性分析 仪测定该样品中的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化程度，其中若该样品中所存在的所有或基本上所有FMRl基因区已甲基化，则将该个体鉴别为mGluR5反应者。在又一方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括提供来自患有FXS的个体的核酸样品；测定该样品中的脆性X染色体智力低下I (FMRl)基因区的甲基化程度，其中若所有FMRl基因区已甲基化，或若FMRl基因区的甲基化程度测定为99. 5%或99. 5%以上，或具有8或8以上的A ct,则将该个体鉴别为mGluR5反应者；及向鉴别为mGluR5反应者的个体给予mGluR5拮抗剂。在又一方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括提供来自患有FXS的个体的核酸样品；测定该样品中的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化程度，其中该样品中相对于对照的甲基化程度指示该个体是否为mGluR5反应者。在另一方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括自患有脆性X染色体综合征的个体分离RNA样品；进行检测以检测该RNA样品中的FMRlmRNA转录物；及若未检测到FMRlmRNA转录物或检测到的FMRlmRNA表达量与对照相比降低，则将该个体归为mGluR5反应者。mRNA转录物可使用本领域中已知的任何方法来检测，包括Northern印迹分析、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、RT_PCRELISA、基于TaqMan的定量RT-PCR (基于探针的定量RT-PCR)及基于SYBR绿的定量RT-PCR。在又一方面，本发明包括一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法；该方法包括自患有脆性X染色体综合征的个体分离样品；进行检测以检测该样品中的FMRl蛋白；及若该样品缺乏FMRl蛋白(FMRP)的存在或与对照相比量降低，则将该个体归为mGluR5反应者。FMRP检测可藉由本领域中已知的任何方法进行，包括ELISA、流式细胞测量术、血液涂片测试(免疫染色)、Western印迹法、HPLC及质谱分析。在本文所述的任何方法中，mGluR5拮抗剂可为(_) - (3aR, 4S, 7aR) _4_羟基_4_间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚-I-甲酸甲酯。附图
简要说明图I描述FMRl启动子及5’ UTR序列。
图2描述显示由F4055-H0002332-M03抗体组合进行人FMRP蛋白检测的温度依赖性信号动力学的柱状图。图3描述显示由MAB2160-F4055抗体组合进行人FMRP蛋白检测的温度依赖性信号动力学的柱状图。图4描述显示原代人纤维母细胞中的内源性人FMRP蛋白检测的柱状图。发明详述本发明部分地基于发现FMRl基因转录沉默的患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体可能对mGluR5拮抗剂治疗作出反应。因此，本发明涉及一种预测患有FXS的个体是否为mGluR5反应者的方法。相关样品中的FMRl基因区的甲基化程度、FMRlmRNA表达缺乏及
FMRl蛋白(FMRP)缺乏可以单独或组合形式充当预测患者对mGluR5拮抗剂的反应性的生物 如本文所使用，“mGluR5反应者”为可能在用mGluR5拮抗剂进行治疗性处理后显示改良的行为症状的患有FXS的个体,如使用异常行为检查表-社区版(AberrantBehavior Checklist-Community Edition ;ABC_C)行为量度所评定(Bihm 等人,Am. J. MentRetard 96:209-211)。ABC-C量测检查各种行为，包括行为刻板、活动过度、言语不当及兴趣狭窄。在用mGluR5拮抗剂治疗后显示ABC-C评分降低的个体归类为mGluR5反应者。亦可藉由其他方法评定行为症状，诸如临床整体印象(Clinical Global Impression ；CGI)量表、社会反应量表(Social Responsiveness Scale ；SRS)或重复行为量表-修订版(Repetitive Behavior Scale-Revised ；RBS-R)。根据此等测试,显示改良的个体亦将确定为mGluR5反应者。mGluR5 拮抗剂本发明可用于测定哪些患有FXS的个体可能对mGluR5拮抗剂治疗作出反应。mGluR5拮抗剂的实例包括肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他候选药物。mGluR5拮抗剂实例之一为(_) - (3aR, 4S, 7aR) -4-羟基-4-间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚-I-甲酸甲酯。mGluR5拮抗剂(_)_(3aR，4S，7aR)-4-羟基-4-间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚-I-甲酸甲酯以及其制造方法揭示于美国专利第7，348，353号中，该专利的揭示内容以引用的方式并入本文中。mGluR5拮抗剂(_)-(3aR，4S，7aR)-4-羟基-4-间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚-I-甲酸甲酯具有以下结构式
d飞Th
H C(O)OMe ；)预期其他mGLUR5拮抗剂，诸如美国专利第7，348，353号中所揭示的mGLUR5拮抗剂用于本发明方法中。
在一实施方式中，mGluR5拮抗剂为式(I)化合物
权利要求
1.一种测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包含 自患有脆性X染色体综合征的个体分离RNA样品； 进行测定该RNA样品中的FMRlmRNA转录物的检测；及 若该样品的FMRlmRNA表达量与对照相比降低，则将该个体归为mGluR5反应者。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，该检测选自Northern印迹分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、RT-PCR ELISA、基于TaqMan的定量RT-PCR (基于探针的定量RT-PCR)及基于SYBR绿的定量RT-PCR。
3.一种测定患有FXS的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包含 自患有脆性X染色体综合征的个体分离样品； 进行测定该样品中的FMRl蛋白的量的检测 '及 若该样品的FMRl蛋白(FMRP)量与对照相比降低，则将该个体归为mGluR5反应者。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该检测选自免疫组织化学、ELISA、流式细胞测量术、Western印迹法、HPLC及质谱分析。
5.一种测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包含 提供来自患有FXS的个体的核酸样品； 测定该样品中的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化程度，其中该样品中相对于对照的甲基化程度指示该个体是否为mGluR5反应者。
6.一种测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包含 提供来自患有脆性X染色体综合征的个体的核酸样品； 测定该样品中的脆性X染色体智力低下I(FMRl)基因区的甲基化程度 '及 若该样品中所存在的FMRl基因区完全甲基化，则将该个体归为mGluR5反应者。
7.如权利要求1、3、5或6中任一项所述的方法，其特征在于，该mGluR5拮抗剂为(-)-(3aR, 4S, 7aR)-4-羟基-4-间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚^-甲酸甲酯。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该测定可使用选自以下的检测进行甲基化敏感性限制酶消化与Southern印迹法或定量PCR (基于探针或SYBR绿)中至少一者组合；或亚硫酸氢盐DNA修饰与甲基化特异性PCR(MSP)、定量甲基化特异性PCR(基于探针或SYBR绿)或焦磷酸测序中至少一者组合。
9.一种测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包含 测定来自患有FXS的个体的样品中FMRlmRNA转录物、FMRl蛋白的存在、或FMRl基因区的甲基化或其任何组合；及 若该样品的FMRlmRNA含量与对照相比降低、FMRl蛋白的量与对照相比降低、或若所存在的FMRl基因区完全甲基化，则将该个体归为mGluR5反应者。
10.如权利要求9所述的方法，其中该方法包含测定FMRlmRNA及FMRl蛋白的存在。
11.如权利要求6、8或9中任一项所述的方法，其特征在于，该FMRl基因区为SEQIDNO:I、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3。
12.如权利要求1、3、5、6或9中任一项所述的方法，其特征在于，该方法进一步包含给予mGluR5拮抗剂。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该mGluR5拮抗剂为(-)-(3aR, 4S, 7aR)-4-羟基-4-间甲苯基乙炔基-八氢-吲哚-丨-甲酸甲酯。
14.一种诊断试剂盒，其用于测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体是否为mGluR5拮抗剂反应者，该试剂盒包含 用于量测FMRlmRNA转录物、FMRl蛋白含量、或FMRl基因区的甲基化或其任何组合的试剂； 及使用说明书。
全文摘要
本发明涉及生物标记用于测定患有脆性X染色体综合征(FXS)的个体对mGluR5拮抗剂治疗的反应性的用途。
文档编号C12Q1/68GK102869791SQ201180021907
公开日2013年1月9日 申请日期2011年4月28日 优先权日2010年4月30日
发明者B·戈麦斯-曼斯拉, Y·何, D·约翰斯, J·迈耶, C·保丁 申请人:诺华有限公司