用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架的制作方法

专利名称：用于提高多能干细胞分化成肝细胞的3维支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及合成或动物来源的3维(3D)生物支架作为基体用于提高hPS (人类多能干细胞)的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞类型。
背景技术：
哺乳动物细胞培养多年来，哺乳动物细胞培养方法已被改善和标准化，并且允许细胞生长、扩增和分化所需要的条件已被充分确定。细胞可以在无菌塑料表面例如聚苯乙烯上常规培养，所述塑料表面往往与基质涂层一起使用，所述基质涂层被设计成更接近地重现细胞会正常生长的体内环境。在胚胎干细胞的情况下，往往需要饲养细胞层例如小鼠胚胎成纤维细胞层来为营养和支持所述细胞的·增殖提供更好的基体。典型地，哺乳动物细胞被培养在通常含有添加剂例如胎牛血清的支持性培养基中，所述培养基除了向细胞提供各种激素和生长因子之外，还含有同样有助于复现细胞生长的理想微环境的许多细胞基质组分。当前，哺乳动物细胞培养具有各种各样的下游应用，包括它们在基础研究中的应用、它们在药物和毒理学分析中的应用和它们在产生正确折叠的重组哺乳动物蛋白中的应用。最近，哺乳动物细胞培养已被进一步开发用于再生医学领域，由此获取组织例如皮肤真皮层并将其增殖一定的时间段，以便生成更大量的组织以供临床外科用，例如修复外伤性损伤之后的伤口或修复患病的内脏器官。可是，从原代来源获得的细胞在它们进一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要复杂的生长培养基配方和生长条件来进行成功培养。由于免疫排斥的问题，它们在再生医学中的应用也有限。最近，在旨在越过这些障碍的胚胎干细胞研究领域中有许多进展。这种多能干细胞不仅能够几乎无限地增殖，它们还具有分化成构成完全发育的生物体的每种细胞和组织类型的能力。因此，多能干细胞在开发新药的试验中可能是重要的工具，并且因为它们的供应实际上是无限的，因此它们提供了更廉价并且可变性较少的来源。3D生物支架多能干细胞分化中的主要挑战之一是控制分化，使得始终产生成熟、功能完全的细胞类型而不是部分分化、不成熟的前体细胞或各种细胞类型的高度异质性混合物。使多能干细胞分化的最简单方式是在2D塑料基体上，但不幸的是，这往往产生缺乏成熟细胞类型的特征性表型的分化细胞。这部分是由于不能复现干细胞在正常胚胎发生期间所经受的条件，正常胚胎发生过程与2D培养物的不同之处在于它当然是在3维中发生的。研究人员试图解决这个问题的一种方式是开发新的3D培养系统，所述新的3D培养系统旨在更忠实地复现细胞在胚胎发生期间所经受的一些条件并让它们以更天然的方式分化。特别是，这样的3D系统允许细胞在更大的程度上彼此相互作用，并允许开发比利用2D细胞培养观察到的任何物体更类似于功能性器官的复杂的多细胞聚集体。
3D系统依赖于生物活性支架的存在，细胞可以接种并可以粘着在所述支架上。这样的支架必须有助于引导细胞以所需的3D构造生长和增殖，并且也可能需要提供帮助细胞形成所需结构的某些分子信号。生物支架的另一个重要要求是它们是可放大的，以便组织生长和细胞分化可以在更大、更经济的规模上进行。支架可以由各种材料构成，正确的支架选择在引导接种到其上的任何细胞的生长、增殖和分化中可能是关键的。例如，支架通常由安排成多孔海绵形式的聚合材料构成。于是，接种到这种支架中的细胞可以通过支架内部相互连接的管道和通道网络在所述支架的孔结构内部粘着和生长，当选择适合的支架时，孔径是重要的考虑因素。生体活性剂例如细胞外基质(ECM)组分，在沉积到支架表面上时，也可以用来增强支架功能，以容许更好的细胞粘着。最终的结果是为细胞提供一种体外环境，使细胞可以在其中更切实可行地并且以更接近地类似于它们正常的体内家园的方式进行相互作用。在几种培养系统中，添加细胞外基质诱导细胞极性和组织的组织化。例如，当用第二层胶原蛋白进一步覆盖培养在平的胶原蛋白层上的单层原代肝细胞时，即所谓的夹心培养，与常规2D培养物的肝细胞相比，所述细胞显示出形态和功能改善(Dunn，J.等，1991)。所述覆盖层导致细胞保持肌动蛋白丝与体内状态相似，与此相反，在2D对照培养中看到异常的应激纤维形成(Berthiaume，F.等，1996)。生理更相关的细胞骨架组织化和随后的细胞极性与形状可能引起肝功能性提高，但是后来认为，夹心培养的有益效应主要起因于改善的细胞-细胞接触而不是细胞与细胞外基质的接触(Hamilton, G.等,2001)。胶原蛋白支架也已被用于将胚胎干细胞分化成肝细胞。Baharvand和同事发现，与传统2D中分化的细胞相比，肝细胞样细胞在胶原蛋白支架内部的分化改善了形态特征、基因表达模式和代谢活性(Baharvand, H.等，2006 )。藻酸盐提供了多孔非粘着 性3D支架，支持肝细胞聚集形成强烈的细胞-细胞相互作用，导致肝功能改善(Dvir-Ginzberg, M.等,2003)。藻酸盐基质中的环境还支持新生大鼠肝细胞的分化(Dvir-Ginzberg, M.等,2008)和 HepG2 成熟(Elkayam, T.等,2006)为更成熟的功能性表型。另外，当将C3A肝细胞系作为球状体在藻酸盐中进行培养时，因为许多不同CYP的酶活性比在2D单层培养中增加，因此，C3A肝细胞系显示出药物代谢提高(Elkayam, T.等,2006)。最近,市场上已推出几种用于提供3D支架以支持细胞培养的新产品，包括已被发现改善肝细胞培养条件的3D交织纳米纤维支架(Wang, S.等,2008)。另夕卜，多孔聚苯乙烯支架提供了空间，能够让细胞生长和分化并形成具有复杂的3D细胞-细胞相互作用的层(Bokhari, M.等,2007a ;Bokhari, M等,2007b)。在这些支架中，HepG2响应于生化试剂的方式远比在2D中培养的细胞更加类似于体内组织的活性(Bokhari, M.等，2007a)。另外，小鼠ES细胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作为球状体成功地向肝细胞分化，目的在于通过组合生长因子处理和多细胞球状体形成来发展大量分化培养法(massdifferentiation culture method) (Matsumoto, K.等，2008)。肝细胞培养肝功能衰竭和终末期肝脏疾病在全世界造成为数巨大的死亡并且是医疗保健系统的主要负担。肝脏移植仍然是最成功的治疗。可是，这种方法的功效有限并且与许多并发症例如感染或排斥关联。肝脏移植还具有可利用的供体器官短缺的缺点，并且被治疗的患者往往需要终身免疫抑制治疗。通过减少对器官的需要，基于细胞的治疗对于社会和患有这些严重疾病的个体都将是极为重要的。此外，肝脏是人体中代谢和解毒的中心，因此为了鉴定用于体外试验的功能性细胞类型的可靠来源，已经进行了大量的尝试。不幸的是，目前可利用的任何细胞类型都不能真实反映肝脏的复杂性和功能。从hPS细胞生成肝细胞样细胞的方法往往包括胚状体的形成和/或基于添加细胞毒性化合物进行早期选择，所述肝细胞样细胞可以进一步分化成成熟肝细胞(Rambhat I a, L.等,2003)。这些选择步骤,特别是胚状体的形成,往往导致大量细胞损失并进而导致效率低下。该方法是复杂的，大多数具有非常长的世代时间并包括几个耗时的步骤。因此，需要迅速和简单的方法用于形成源自于未分化的hBS细胞的肝细胞样细胞。以前用于获得肝细胞样细胞的尝试，例如如US20030003573中所公布的，产生了与起始材料有关的低收率。此外，原代人类肝细胞的可利用性非常有限，并且还知道，所述细胞在用于体外应用时迅速失去它们的正常表型和功能性质。一种经常使用的原代细胞替代物是转而包含非常低水平(或完全缺乏)的代谢酶并且其他重要蛋白质的分布与体内天然肝细胞显著不同的肝细胞系。因此，虽然已知肝脏代谢是物种特异性的并因此在预测所测试的物种以外的其他物种的肝脏代谢和毒性中产生困难，但许多试验仍然使用动物材料来进行。在药物开发中，肝脏不良反应仍然是最突出的副作用。因此早期预测发生人类肝脏毒性的倾向性在选择化合物进入临床试验时具有至高的重要性。提高这方面的能力的尝试必须解决可利用性问题和模型建立这两者，这为与引起人类肝脏不良损伤相符的复杂生物过程提供更好的覆盖度。因此，迫切需要一种模型系统，所述模型系统模拟人类肝细胞，而且能够在新药或化学品的开发中预测候选分子的效应。就可利用性和生理相关性这两方面而言，hPS细胞可以担任功能性人类肝细胞的理想的可再生来源。

发明内容

本发明的发明人已经制定了许多稳妥的方案，这些方案允许将hPS细胞、肝细胞前体细胞或肝细胞祖细胞接种到3D生物支架上，以可再现地和可放大地产生具有成熟的形态和功能的肝细胞。本发明包括用于提高人类多能干细胞(hPS)分化成肝细胞祖细胞或肝细胞细胞类型的方法，其中所述hPS细胞初始被培养在2维培养表面上，然后转移到一组定义的3D生物支架之一上用于进一步分化和成熟。hPS细胞初始也可以在2维表面上部分分化成肝细胞祖细胞类型。随后，将肝细胞祖细胞或hPS细胞接种到裸露的3维支架或已经涂覆有基质化合物的支架上，并进一步培养。作为本发明的重要方面，本发明人已经发现，通过将hPS细胞在2D环境中初始生长并任选初始分化，然后将所述细胞转移到3D环境中，显著增加了肝细胞相关基因的表达和肝细胞相关酶的产生。定义在本文中使用时，“人类多能干细胞”(hPS)是指可以源自于任何来源并且在适合的条件下能够产生源自于全部3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的不同细胞类型的人类子代细胞的细胞。hPS细胞可以具有在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成可识别的所有三个胚层的细胞的能力。人类多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括人类胚胎干(hES)细胞(参见，例如，Thomson, J.A.等(1998)，Heins, N.等(2004))，以及诱导的多能干细胞(参见，例如Yu，J.等，(2007) ;Takahashi，K.等(2007))。本文中描述的各种方法和其他实施方式可能需要或利用来自各种来源的hPS细胞。例如，适合使用的hPS细胞可以从发育中的胚胎获得。另外或可选地，合适的hPS细胞可以从建立的细胞系和/或人类诱导的多能干(hiPS)细胞获得。在本文中使用时，“hiPS细胞”(也称为“iPS”)是指人类诱导的多能干细胞。在本文中使用时，“定型内胚层(DE)”和定型内胚层细胞(DE细胞)是指表现出例如但不限于定型内胚层细胞典型的蛋白质或基因表达和/形态的细胞，或者包含大量与定型内胚层细胞类似的细胞的组合物。在本文中使用时，“肝前体细胞”或“肝祖细胞”是指表现出例如但不限于定型内胚层细胞典型的蛋白质或基因表达和/或形态的标志物的细胞，或者包含大量与肝前体细胞或肝祖细胞的细胞类似的细胞的细胞组合物。在本文中使用时，“肝细胞”或“肝细胞样细胞(HCLC)”用来表示表达至少一些成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和CYP2D6的细胞类型。在本文中使用时，“hESC-HEP”用来表示源自于人类胚胎干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6 的
细胞类型。在本文中使用时，“hiPS-HEP”用来表示源自于诱导的多能干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A 4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的细胞类型。在本文中使用时，“无异源(Xeno-free)”是指细胞系或细胞材料从来没有直接或间接暴露于非人类动物来源的材料，例如细胞、组织和/或体液或其衍生物。在本文中使用时，“Wnt信号转导”是指Wnt信号转导中所包括的途径，如例如Nejak-Bowen 和 Monga (2008)中所综述的。在本文中使用时，HDAC抑制剂是指组蛋白去乙酰化酶抑制剂。在本文中使用时，“GSK抑制剂”是指抑制GSK(尤其是GSK3，包括GSK3a或GSK3 3 )的化合物。用于本发明的优选GSK抑制剂的实例包括下列的一种或多种:BIO (2，Z, 3’ E)_6_ 溴靛红 _3’ -肟(GSK3 抑制剂 IX)；BIO-丙酮肟(2’ Z, 3’ E)_6_溴靛红_3’ -丙酮肟(GSK3抑制剂X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制剂XIII);吡啶咔唑-环戊二烯钌复合物(GSK3抑制剂XV)；TDZD-8 4_ 苄基 _2_ 甲基-1, 2，4_ 噻二唑啉 _3，5_ 二酮(GSK3 β 抑制剂 I)；2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]_噁二唑(GSK3 3抑制剂II)；0TDZT2, 4_ 二苄基_5_氧代噻二唑啉_3_硫酮(GSK3 β抑制剂III)；a -4- 二溴苯乙酮(GSK3 β 抑制剂 VII);AR-AO 14418 N-(4-甲氧基苄基)-N’- (5_ 硝基 _1，3_ 噻唑 _2_ 基)脲(GSK-3 β抑制剂VIII)；
3-(1-(3-羟丙基)-1H_吡咯并[2，3_b]卩比啶_3_基]_4_吡嗪_2_基-批咯-2，5- 二酮(GSK-3 β 抑制剂 XI);TffSI 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3 β抑制剂XII);L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 或其肉豆蘧酰化形式(GSK3 β 抑制剂 XIII);和2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)_乙酮(GSK3 3抑制剂VI);和氨基嘧啶CHIR99021。另外，许多无翅型蛋白或Wnt蛋白的功能与GSK抑制剂、特别是本发明的GSK抑制剂相似。因此，它们被归入术语GSK抑制剂下。可以用于本发明的不例性 fct 蛋白包括 Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wntl0、Wntl4、Wntl4b、Wntl5 和 Wntl6中的一种或多种，以及其他fct蛋白。优选使用Wnt3a。此外，小分子可用于指导Wnt信号转导。同样，对诱导Wnt信号转导的GSK33阻断剂或抑制剂可以用于调节Wnt信号转导以实现指导分化和成熟。可以在起动之后较晚的阶段或在诱导发生之前诱导fct信号转导途径。在本文中使用时，“CYP”用来表示细胞色素P，更具体地是表示细胞色素P450，细胞色素P450是肝脏的主要I相代谢酶，由许多不同的同工酶组成，例如CYP1A1、CYP1A2、CYPlBU CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7 和 CYP7A1。在本文中使用时，术语“GST”用来表示谷胱甘肽转移酶，其亚型的实例是GSTAl-UGST Ml-1 和 GST Pl-10 在本文中使用时，术语“UGT”用来表示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶，它是催化葡萄糖醛酸化活性的一组肝脏酶。在本文中使用时，术语“细胞色素P450还原酶”(亦称CPR)用来表示其生理功能是通过电子转移来还原细胞色素P450酶并因此是细胞色素P450酶介导的反应所需要的蛋白质。术语“功能性药物代谢酶”用来表示属于I相和II相酶的功能性酶，所述I相和II相酶执行异源生物物质和药物的化学修饰，即所谓的药物或异源生物物质代谢。在本文中使用时，术语“功能活性”是指有效的可测定的肝细胞功能，例如药物转运蛋白的可测定的药物转运以及细胞色素P450 (CYP)的可测定的酶代谢，它们通常是在原代人类肝细胞中被检测到的。在本文中使用时，术语“胚外内胚层(ExE)”用来表示分化的内胚层细胞，它们与定型内胚层相反，在人类发育中将构成胚胎外部的区室，例如卵黄囊。在本文中使用时，术语“AAT”用来表示肝脏标志物α-抗胰蛋白酶。在本文中使用时，术语“醇脱氢酶I”用来表示一种脱氢酶类型，其促进醇与醛或酮之间的相互转化，其中将NAD+还原为NADH。醇脱氢酶I起到分解原本可能有毒的醇的作用。在本文中使用时，术语“AFP”用来表示肝脏标志物α-甲胎蛋白。在本文中使用时，术语“BSEP ”用来表示胆汁转运蛋白胆盐输出泵。在本文中使用时，术语“CK”用来表示肝脏标志物细胞角蛋白(可互换使用)，它有不同的亚型，例如细胞角蛋白18 (CK18/KRT18)、细胞角蛋白19 (CK19/KRT19)、细胞角蛋白8 (CK8)和细胞角蛋白7 (CK7)。
在本文中使用时，术语“FGF”是指成纤维细胞生长因子，优选为人和/或重组来源的，属于它的亚型是例如“bFGF”(是指碱性成纤维细胞生长因子，有时也称为FGF2)和FGF4。“aFGF”是指酸性成纤维细胞生长因子(有时也称为FGF1)。在本文中使用时，术语“BMP”是指骨形态发生蛋白，优选为人和/或重组来源的，属于它的亚型是例如BMP4和BMP2。在本文中使用时，术语“HGF”是指肝细胞生长因子，优选为人和/或重组来源的。在本文中使用时，“HNF3i3 ”或“HNF3b”可互换使用，用来表示肝细胞核因子3，它是调节内胚层来源的组织例如肝脏、胰岛和脂肪细胞中基因表达的转录因子。HNF3 0有时也可以称为HNF3b或Fox2A,后一名称起源于该转录因子是叉头框(Forkhead box)转录因子家族的成员。在本文中使用时，术语“0CT-1”用来表示有机阳离子转运蛋白I。0CT-1是主要的肝转运蛋白，它介导许多有机阳离子从血液摄取到肝脏中，化合物可以在肝脏中被代谢或分泌到胆汁中。在本文中使用时，术语“MDR”用来表示多药耐药性转运蛋白。MDRl和3是ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族的成员，二者都是药物外排转运蛋白。MDRl在调节药物、肽和异源生物物质运输到身体中以及在保护身体对抗异源生物物质损伤和药物毒性方面是重要的，而MDR3是磷脂分泌到胆汁中所必不可少的。在本文中使用时，术语“激活素”用来表示一个TGF-β家族成员，它表现出范围广泛的生物活性，包括调节细胞增殖和分化，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素属于常见的TGF-β配体超家族。在本文中使用时，术语“ROCK抑制剂”用来表示ROCK Rho激酶的小分子抑制剂，例如Y-27632或法舒地尔。 在本文中使用时，术语“无异源”用来表示完全避开了直接或间接暴露于非人类动物组分。在本文中使用时，术语“肝细胞毒性”是指细胞反应例如坏死性毒性、凋亡、线粒体毒性、磷脂沉积、脂肪变性和胆汁酸转运。发明的具体描述本发明的一个方面涉及用于将人类多能干细胞(hPS)或肝细胞前体细胞分化成成熟肝细胞或肝细胞样细胞的方法，所述方法包括以下步骤:i)在2维表面上接种hPS或肝细胞前体细胞以起始分化ii)将步骤i)的初始分化的细胞转移到3维(3D)支架上用于进一步分化和成熟。然而，所述细胞在3D支架上的接种密度可以高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。此外，可以添加Rho激酶(rock)抑制剂和/或可以在无饲养细胞或无异源的条件下执行所述方法。本发明的方法中所使用的细胞可以是无异源的细胞，例如无异源的hPS细胞系或来源于无异源的hPS细胞系的细胞，或者所述细胞可以是人类胚胎干(hES)细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。本发明的肝细胞前体细胞可以是定型内胚层(DE)细胞或不是定型内胚层细胞，并且可以具有胚胎内胚层或肝内胚层的特征。可以在2至25天、例如4至15天之后执行从步骤i)到ii)的过渡，即将步骤i)中获得的细胞转移到3D支架上(步骤ii)。3维支架可以选自下列类型之一:i)多孔藻酸盐海绵，ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物，iii)乳液模板型聚苯乙烯，iv)合成纳米纤维复合物，V)具有至少一个非直立侧壁的微孔装置，vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵，或者所述3维支架可以是另一种合适的类型。多孔藻酸盐海绵可以具有50-200 μ M的孔径，而乳液模板型聚苯乙烯支架的孔径在0.1-1000 μ M、例如15-45 μ M范围内。此外，本发明涉及如上所述的方法，其中3D支架是未涂覆的。在另一个方面，用例如一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。这样的细胞外基质组分的实例包括:明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸水凝胶、丝纤蛋白、壳聚糖、或任何前述项的复合物。本发明的3D支架可以被包含在合适的培养容器内，所述培养容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板,或其他合适的·细胞培养容器。因此，本文详述的发明包括用于提高hPS细胞向更具肝脏表型的细胞或最终具有部分或完全成熟的肝脏表型的细胞分化的方法，这种方法要求细胞初始被培养在2维培养表面上，然后转移到六种可能的3维支架之一上。肝脏表型的这种改善与任何具体的细胞培养基的组成无关(对于所采用的细胞培养方案的详情，参见图9)。根据基因表达和代谢研究，本发明的发明人发现，与更传统的2D基体相比，3D支架为hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的成熟和进一步分化提供了更好的环境(

图1-6)。此外，本发明人发现，当将细胞培养在2D表面上、然后将所述细胞接种到3D环境中时，有进一步的效果。这可以通过比较几种肝脏标志物基因例如Cyp2C9、白蛋白、Cyp3A4和UGT2B7的表达看出，所述标志物基因在3D支架上培养的细胞中的表达均比在2D表面上培养的细胞中的表达高，而与细胞系、基质涂层、培养天数或所选的支架无关。特别是，当被培养在3D中时，许多肝转运蛋白(BSEP、FABPl、MRP2、NTCP, 0ATP2、OCTI)的表达水平高得多，表明肝细胞更成熟和更具功能。在一系列不同的支架类型上，包括拓扑形态支架(topographicalscaffolds)例如 Ultraweb (图 3)和 Aggrewell (图 5)、多孔海绵类型例如 AlgiMatrix (图2)和聚L-赖氨酸(图6)，以及在基于合成聚合物的支架例如Artelon (图1)和Alvatex (图4)上，都可以看到这种结果。可以预先用基质组分涂覆3D支架，以更好地类似于肝细胞正常遇到的体内微环境。特别是，基质组分明胶和基质胶已经显示出在与支架一起使用时提高一些肝脏标志物的表达水平。几种标志物(TAT，CYP2C9，0ATP2)在基质胶涂覆的Artelon (Artimplant)上的表达高于未涂覆的(图1C和E ;图1A和D)。许多标志物(TAT和UGT2B7)在基质胶涂覆的Alvatex上的表达显著高于未涂覆的(图4F和G，在第18天时分析)，并且对于几种其他标志物(例如TAT，UGT2B7)也是如此，它们在明胶涂覆的Alvatex上的表达程度高于未涂覆的(图4E和G)。根据希望看到哪种标志物高度表达，可以任选应用本发明的这种具体实施方式
。因为特定的标志物组的表达将暗含肝谱系的某些表型或阶段，因此，本发明这方面的运用可以允许程度更精细地控制所生成的肝细胞的功能性。这方面的扩展是可以向接种到3D支架上的hPS细胞或hPS来源的肝祖细胞添加一种或多种不同的细胞类型，使得在3D支架上共同培养细胞系。值得注意的是，可以将细胞以不同的相对密度接种在3D支架上。相对密度可以是标准的Xl密度(即，与接种在2D对照表面上的细胞密度相同)或高三倍的初始密度(表示为x3)或高10倍的密度或其间的任何密度。图1H和I显示，当使用未涂覆的Artelon(Artimplant)时，标志物0ATP2、0CT1和TAT的表达在以较低的xl初始密度接种的细胞中更高。某些标志物(例如CYP7A1)在未涂覆的Alvatex上以x3接种的细胞中的表达也比以xl接种的细胞中的表达低(图4N和0)，但其他标志物(例如OCTl)在未涂覆的Alvatex上以x3接种的细胞中具有更高的表达(图41和K)。因此，这种具体实施方式
的运用也取决于使用者需要的肝细胞的期望表型。为了容许控制分化，细胞被接种到3D支架上时的分化阶段是相关的，即被接种到3D支架中之前培养较长时间则表型更成熟。hPS细胞可以在几个不同的分化阶段，例如作为未分化的细胞(第O天)、或用激活素A进行定型内胚层诱导处理之后(第4-7天)、或作为肝前体细胞(第9、11、13、14和15天)，被接种到所述支架中用于在3D支架中成熟。在接种到支架上之前，可以对这样的前体细胞进行表征，以确定它们是处于胚胎内胚层谱系(图11)还是更晚期的肝细胞前体(图12)，依据的是这两个阶段特征性的所定义的标志物基因的表达。在被培养在Artelon (Artimplant)上的细 胞中容易观察到差别，其中例如在14天时接种的细胞中OCTl的表达水平几乎是在第11天时接种的细胞的两倍(图1F和H)。与此相反，在14天时接种到Artelon (Artimplant)上的细胞中，0ATP2的水平比在第11天时接种的细胞低(图1J和M)。在被培养在Alvatex上的细胞中也可以看出这种趋势，其中14日龄接种的细胞同样具有比11天细胞低的0ATP2表达水平，这可能表明0ATP2是更不成熟的肝细胞表型的标志物(图41和J)。以类似的方式能够看出，在更年轻时(第11天)接种的细胞中OCTl的水平也比更成熟(第14天)的细胞中的高(图4N和P)。因此，细胞培养和分化时间的长度是本发明在控制所产生的细胞的最终表型方面的重要因素，并可以相应地进行改变。如图9和下面表中所概括的，可以调整培养的持续时间和培养基组成，以优化通过本文中公开的方法获得的细胞的成熟度和发育阶段。相关的方面涉及细胞在接种到支架上之前所接受的分化方案，如实施例2中所详述的，特别是细胞是否暴露于含有Rho激酶ROCK抑制剂的培养基，这种抑制剂被用来在2D和3D两阶段中传代和接种之后提高存活率和再粘着。已经观察到，与生长在常规的2D表面上的肝细胞相比，接种到3D支架上的肝细胞中的功能和代谢活性改善。根据实施例6，在3D支架中成熟的hESC来源的肝细胞，当暴露于药物非那西汀(APAP)、咪达唑仑或双氯芬酸时，显示出比2D对照培养更高的CYP活性诱导(图7和8、10),其中Alvatex支架显示出比Ultraweb更高的诱导。对培养在Alvatex(Reinnervate)上的细胞的进一步研究显示,在起始分化之后23和29天时,如由CYP2C9活性所测定的，那些细胞均比培养在2D表面上的细胞具有高得多的代谢活性。CYP2C9活性在培养在3D表面上的细胞中已经是高的，但是当用双氯芬酸处理细胞时还观察到升高(图8)。这再次显示在3D支架上分化的肝细胞在与2D培养物细胞相比时，具有优异的肝细胞代谢功能。这些结果得到以下实验结果的支持:当对药物咪达唑仑的细胞代谢分解产物进行分析时，发现与2D对照相比，关键的肝脏标志物CYP3A在培养在基质胶涂覆的Alvatex(Reinnervate)上的细胞中的水平也较高,在培养在Ultraweb上的细胞中的水平略高(图8)。因此，本发明已经显示了在培养在3D支架上的细胞中肝代谢活性提高的几个实施例。因此，正如以上的讨论，本发明的一方面涉及一种方法，其中如由一种或多种CYP标志物例如CYP2C9或CYP3A的表达增加和/或选自CYP1A1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT的肝细胞相关遗传标志物的水平升高所显示的，肝细胞或肝细胞祖细胞表现出代谢活性升高。此外，本发明的一方面涉及一种方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞表现出一种或多种肝相关转运蛋白例如BSEP、FABPl、MRP2、NTCP、0ATP2、OCTl的表达增加。正如以上的讨论，本发明方法刺激了肝细胞或肝细胞祖细胞与非肝细胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο前述权利要求任一项的方法，其中将肝细胞或肝细胞祖细胞与至少一种其他细胞类型共同培养在3D支架上，所述其他细胞类型选自但不限于:星形肝细胞、肝免疫(Kuppfer)细胞、肝内皮细胞、胆管上皮细胞或成纤维细胞。因此并且正如以上的讨论，本发明的一方面涉及可通过本文中描述的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞或者包含hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的组合物。本发明的其他方面涉及通过本文中的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞或者包含hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞的组合物在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。所述组合物还可以包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸盐海绵、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型 聚苯乙烯或合成纳米纤维复合物。
实施例实施例L来源于人类多能干细胞的肝细胞的起始材料所有hPS细胞(如上所定义)均可被用作本发明的起始材料。对于下面的实施例而言，肝细胞样细胞在体外来源于被培养在mEF细胞上的未分化人类胚胎干细胞(hESC)(Heins, N.等2004，Stem Cells)。用于这个实验的细胞系可以是、但不限于hES细胞系SA002、SA121、SA181、SA461 (Cellartis AB，CiGteborg,瑞典，http://www.cellartis.com),并且它们可以如Heins，N等2004所描述的进行增殖。在NIH干细胞登记处、UK干细胞库和欧洲hESC登记处中列出了这些细胞系，并且可通过请求来获得这些细胞系。与从hESC获得的hPS—起，从hiPS (诱导的多能干细胞)获得的hPS已被用于在本发明实施例中获得肝细胞。在这种情况下，“hiPS-HEP”用来表示源自于诱导的多能干细胞并表达成熟的肝脏标志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的细胞类型(也参见“定义”)。无异源的iPS细胞或无异源来源的hES细胞系例如SA611(Cellartis AB, GSteborg，瑞典,http://www.cellartis.com)的应用可以任选让整个发明
在无异源的条件下用于产生无异源的细胞产物。实施例2.
利用3D支架从人类多能干细胞获得肝细胞
按照下面详述的方案a-e，从hES细胞和人类hiPS细胞二者获得肝细胞。在开始分化之前，用PBS洗涤培养物两次。新鲜制备不同的培养基(表1)，并从O天以后根据方案概述添加所述培养基。在初始分化(ID)步骤期间，每天或每两天更换培养基，以后每两天或每三天更换培养基。每个实验只使用一种细胞系，但是任选在将初始细胞系接种到3D支架上时可以添加第二种(或更多种)细胞系，让所述细胞共同培养。除了在实验114和116中，2D培养物被接种在明胶涂覆的培养容器上之外，2D培养物均被接种在基质胶涂覆的培养容器上。2D培养物以150.000-200.000细胞/cm2进行接种。下表显示了关于不同实验、哪种细胞系被用作起始材料、如图9中概括的不同形式的分化方案、分化方案中细胞被接种到3D支架中时的时间、对细胞进行分析时的分化时间、和在接种到支架中时是否向培养基添加了 IOmM ROCK抑制剂的概述(对于所采用的方案的示意性细节，也参见图9):
权利要求
1.关于将人类多能干细胞(hPS)或肝细胞前体细胞分化成肝细胞祖细胞、肝细胞样细胞或成熟肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤: i)在2维表面上接种和生长hPS或肝细胞前体细胞以起始分化 ii)将步骤i)的初始分化的细胞转移到3维(3D)支架上用于进一步分化和成熟。
2.权利要求1的方法，其中细胞在3D支架上的接种密度高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。
3.权利要求1的方法，其中在细胞存活因子例如ROCKRho激酶抑制剂的存在下接种细胞。
4.述权利要求任一项的方法，其中在无饲养细胞的条件下执行步骤i)或ii)中的至少一个。
5.述权利要求任一项的方法，其中在无异源的条件下执行步骤i)或ii)中的至少一 个。
6.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞或肝细胞前体细胞是无异源的细胞，例如来源于无异源的hPS细胞系。
7.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是人类胚胎干(hES)细胞。
8.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是诱导的多能干(iPS)细胞。
9.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞是定型内胚层(DE)细胞。
10.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞不是定型内胚层(DE)细胞。
11.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有胚胎内胚层的特征。
12.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有肝内胚层的特征。
13.述权利要求任一项的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，将步骤i)中获得的细胞转移到3D支架上(步骤ii)。
14.述权利要求任一项的方法，其中3D支架选自下列之一: i)多孔藻酸盐海绵 ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物 iii)乳液模板型聚苯乙烯 iv)合成纳米纤维复合物 V)具有至少一个非直立侧壁的微孔装置 vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵。
15.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径为50-200μ M的多孔藻酸盐海绵。
16.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径在0.11000 μ Μ、例如15-45 μ M范围内的乳液模板型聚苯乙烯支架。
17.述权利要求任一项的方法，其中3D支架是未涂覆的。
18.权利要求1-16任一项的方法，其中用一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。
19.权利要求18的方法，其中一种或多种细胞外基质组分选自:明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、聚赖氨酸、玻连蛋白、透明质酸、透明质酸水凝胶、丝纤蛋白、壳聚糖、或任何前述项的复合物。
20.述权利要求任一项的方法，其中支架被包含在合适的培养容器内，所述培养容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合适的细胞培养容器。
21.述权利要求任一项的方法,其中如由一种或多种CYP标志物例如CYP2C9或CYP3A的表达增加所显示的，肝细胞或肝细胞祖细胞表现出代谢活性升高。
22.述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞表现出一种或多种肝相关转运蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、0ATP2、0CT1的表达增加。
23.述权利要求任一项的方法，其中肝细胞或肝细胞祖细胞与非肝细胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο
24.述权利要求任一项的方法，其中将肝细胞或肝细胞祖细胞与至少一种其他细胞类型共同培养在3D支架上， 所述其他细胞类型选自但不限于:星形肝细胞、肝免疫(Kuppfer)细胞、肝内皮细胞、胆管上皮 细胞或成纤维细胞。
25.PS来源的肝细胞、肝细胞样细胞或肝细胞祖细胞，其显示出选自下列的肝细胞相关遗传标志物的水平升高:CYPIA1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
26.权利要求25的hPS来源的肝细胞、肝细胞样细胞或肝细胞祖细胞，其被培养在或已经被培养在3D支架中，并且当与生长在2D表面上的相应细胞相比时，显示出一种或多种以下标志物的水平升高:CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
27.PS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞，其可通过权利要求1-24任一项描述的方法获得。
28.权利要求27的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。
29.合物，其包含可通过前述权利要求任一项描述的方法获得的hPS来源的肝细胞或肝细胞祖细胞。
30.权利要求29的组合物，其还包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸盐海绵、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型聚苯乙烯或合成纳米纤维复合物。
31.权利要求29-30任一项的组合物在治疗、再生医学、药物筛选、毒性测试或药物递送中的应用。
全文摘要
本发明涉及合成或动物来源的3维(3D)生物支架作为基体用于提高hPS(人类多能干细胞)的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞细胞类型。
文档编号C12N5/071GK103097517SQ201180037237
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月11日
发明者杨内·延森 申请人:塞拉帝思股份公司