专利名称：具有粘度改变表型的丝状真菌的制作方法
技术领域：
本发明菌株和方法涉及丝状真菌的基因突变，所述突变产生具有改变的生长特性的变异株。此类变异株非常适于在深层培养物中生长，如用于大规模生产供商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。参考文献·以下参考文献和本文引用的另外的参考文献据此以引用方式并入:Caracuel, Z.etal.(2005) Molecular Plant-Microbe Interactionsl8:1140-47 (Caracuel，Z.等人，2005年，《植物-微生物分子相互作用》，第18卷，第1140-1147页)。Hughes, H.and Stephens, D.J.(2008) Cell Biol.129:129-51 (Hughes, H.和Stephens, D.J.，2008年，《细胞生物学》，第129卷，第129-151页)。Karhinen, L.etal.(2005) Traff ic6:562-74 (Karhinen, L.等人，2005 年，《通讯》，第6卷，第562-574页)。Mouyna, 1.etal.(2005) Molecular Microbiology56: 1675-88 (Mouyna, 1.等人，2005年，《分子微生物学》，第56卷，第1675-1688页)。Passolunghi, S.etal.(2010)Microbial Cell Factories9:7-17 (Passolunghi,
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背景技术：
丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，因而非常适于大规模生产供工业应用的酶和其他蛋白质。丝状真菌通常在生物反应器的菌丝深层培养物中生长，这些生物反应器适于将氧气和营养物质引入培养基(即，培养液)并使氧气和营养物质分布于其中。菌丝体的形态特征会影响培养液的流变性，从而影响生物反应器的性能。通常，培养液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量也越多。在一些情况下，培养液的粘度变得十分高，显著妨碍氧气和营养物质的溶解，从而对真菌的生长产生不利影响。另外，混合粘稠培养液并且向粘稠培养液中通气所需的能量会显著增加生产成本,并且导致在电机和电源供应方面的资本支出更高。
发明内容
本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有可产生粘度改变表型的遗传变更。在一个方面，提供衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含能使变异菌株的细胞与亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Sfb3蛋白的遗传变更，其中变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。在一些实施方案中，功能性Sfb3蛋白的改变量为减少量，并且变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。在一些实施方案中，遗传变更包括亲本菌株中存在的sfb3基因的破坏。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是sfb3基因的全部或部分的缺失的结果。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是包含sfb3基因的基因组DNA的一部分的缺失的结果。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是sfb3基因的诱变的结果。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏使用位点特异性重组进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是将粘度降低表型赋予变异菌株的主要遗传决定因子。
在一些实施方案中，变异菌株不产生功能性Sfb3蛋白。在一些实施方案中，变异菌株不产生Sfb3蛋白。在一些实施方案中，变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。在一些实施方案中，变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与亲本菌株实质上相同。在一些实施方案中，变异菌株每单位量生物质产生的目的蛋白数量与亲本菌株实质上相同。在一些实施方案中，Sfb3蛋白包含如下氨基酸序列:IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL (SEQ ID NO:9，其中X为任何氨基酸残基)。在一些实施方案中，丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)的种。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。在另一个方面，提供产生丝状真菌细胞变异菌株的方法，该方法包括:将遗传变更引入丝状真菌细胞亲本菌株，其中与亲本菌株的细胞相比，所述遗传变更会改变功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。在一些实施方案中，遗传变更能减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液α)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或αυ与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。在一些实施方案中，遗传变更包括使用遗传操作来破坏亲本丝状真菌细胞中的sfb3基因。在一些实施方案中，遗传变更包括使用遗传操作使亲本丝状真菌细胞中的sfb3基因缺失。在一些实施方案中，遗传变更使用位点特异性基因重组进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。在一些实施方案中，变异菌株的每单位量生物质可产生与亲本菌株实质上相同量的蛋白。在一些实施方案中，变异菌株的每单位量生物质可产生与亲本菌株实质上相同量的目的蛋白。
在一些实施方案中，sfb3蛋白包含如下氨基酸序列:IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL(SEQ ID NO:9，其中X为任何氨基酸残基)。在一些实施方案中，丝状真菌是盘菌亚门的种。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉。在一些实施方案中，亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。在一些实施方案中，在引入可减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生的遗传变更之前，编码目的蛋白的基因存在于亲本菌株中。在另一个方面，提供通过前述变异菌株产生的目的蛋白。在另一个方面，提供通过前述方法产生的丝状真菌变异菌株。在另一个方面，提供衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含:(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码目的蛋白的基因，其中所述编码目的蛋白的基因在(a)中的遗传变更之前存在于变异菌株中。在一些实施方案中，遗传变更包括亲本菌株中存在的sfb3基因的破坏。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。在另一个方面，提供针对粘度改变表型筛选变异丝状真菌细胞的方法，该方法包括:(a)诱变丝状真菌亲本菌株的细胞以产生变异细胞；(b)针对改变的荧光染色剂敏感性筛选变异细胞；以及(C)选择具有改变的荧光染色剂敏感性的变异细胞；其中，改变的荧光染色剂敏感性与变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的能力有关，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。在一些实施方案中，改变的敏感性是增加的敏感性，并且变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相t匕，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。在一些实施方案中，荧光染色剂为卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofiuor White)。
在一些实施方案中，诱变细胞是通过基因重组进行。在一些实施方案中，诱变细胞是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。 在另一个方面，提供鉴定盘菌亚门丝状真菌的种中的Sfb3多肽的方法，该方法包括:(a)从盘菌亚门丝状真菌的种获得氨基酸序列；以及(b)针对连续氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (SEQ ID NO:9，其中X为任何氨基酸残基)的存在筛选所述氨基酸序列；(c)其中SEQ ID NO:9在所述得自盘菌亚门丝状真菌的种的氨基酸序列中的存在表明所述得自盘菌亚门丝状真菌的种的氨基酸序列是sfb3多肽。在另一个方面，提供通过前述方法鉴定的分离的sfb3多肽。在又一个方面，提供在丝状真菌细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括:将编码目的蛋白的基因以及可减少细胞中Sfb3蛋白的量或活性的遗传变更引入亲本丝状真菌细胞，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生包含目的蛋白的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量，并且其中目的蛋白在变异细胞中与亲本细胞相比，以实质上相同的水平产生。在一些实施方案中，目的蛋白为超过一种目的蛋白(或一种或多种蛋白)，并且所述超过一种目的蛋白中的每种在变异细胞中与亲本细胞相比，以实质上相同的相对水平产生。在一个具体实施方案中，所述超过一种目的蛋白中的每种选自纤维素酶和半纤维素酶。在一个相关方面，提供通过这种方法产生的目的蛋白。在又一个相关方面，提供包含通过这种方法产生的超过一种目的蛋白的组合物。在一些实施方案中，该组合物是全纤维素酶组合物。由说明书(包括附图)，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施方案将显而易见。
图1 是质粒 pCR-BluntI1-hph_loxP#4 的图谱图2 是质粒 pCR-Blunt I1-T0P0889092 的图谱。图3的小图A-D为培养板图像，显示里氏木霉菌株Morph Λ Sfb3和29-9 Λ Sfb3在含有刚果红的培养基上的菌落形态。(A)Morph Asfb3候选菌株亚群，和(B)相应的对照。(C) 29-9 Asfb3候选菌株亚群，和(D)相应的对照。图4 是质粒 pTrex-Tel-pyrG13/pD0NR221/0927853cre 的图谱，该质粒用来在Morph Δ sfb3菌株中瞬时表达ere基因。图5的图像显示潮霉素B抗性的丢失及质粒pTrex-Tel_pyrG13/pD0NR221/0927853cre瞬时表达后候选菌株在乙酰胺上生长的能力。上排(A-C):指定的培养基上的Morph和Morph Δ sfb3对照菌株。下排(D-F):指定的培养基上质粒瞬时表达后的候选菌株。图6是质粒pNSP23的图谱。图7是用于在70H2中进行互补的四个质粒之一的图谱，该质粒包含具有天然启动子和终止子的野生型sfb3基因。图8的图像显示70H2和29_9转化株在28°C生长四天后(从转化板的第一次转移)在含有潮霉素B的PDA上的生长情况。(A-C)70H2+来自29_9的野生型sfb3。(D-F) 70H2+来自29-9的带有天然启动子和终止子的野生型sfb3。(G) 29-9+单独载体。(H-J) 70H2+来自70H2的sfb3。(K-M) 70H2+来自70H2的带有天然启动子和终止子的sfb3。(N)70H2+单独载体。图9 是质粒 pCR-BluntI1-T0P0949096 的图谱。图10的图像显示⑷转化了 pCR-BluntI1-T0P0949096的70H2转化株的生长情况，该质粒包含从菌株29-9获得的野生型sfb3基因。菌株是用VMH(含潮霉素B的Vogel基本培养基)在28°C下温育。两个候选菌株具有野生型表型(W)，两个候选菌株具有70H2表型(H)，还有两个候选菌株具有中间表型(I)。(B)70H2sfb3#24、70H2和29_9在28°C下生长4天然后在室温下生长3天后，在VM (VogeI基本培养基)上的对比。图11显示!134和!134八8作3#1009在281:生长4天后在指定的培养基上的菌落形态。图12显示在28°C下指定时间段后，液体培养物中的H3A和H3A Λ sfb3#1009菌丝的图像。图13显示Sfb3蛋白的氨基酸序列比对,这些蛋白来自酿酒酵母(S.cerevisiae)(SEQ ID NO:1)及里氏木霉(SEQ ID NO:2)。图14显示Sfb3蛋白的氨基酸序列比对，这些蛋白来自酿酒酵母(SEQID NO:1),里氏木霉(SEQ ID NO:2)及米曲霉(A.0ryzae) (SEQ ID NO:3)。
具体实施例方式
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1.综沭本发明的菌株和方法涉及具有影响其形态和生长特性的遗传修饰的变异丝状真菌细胞。当变异细胞在深层培养物中生长时，它们产生的细胞培养液与包含亲本菌株的细胞的细胞培养液相比具有不同的流变性。这些变异菌株中有一些非常适于大规模生产酶和其他商业上重要的蛋白质。IL 定义在详细描述本发明菌株和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语应当被赋予其在相关领域中使用的普通含义。如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门盘菌亚门的丝状真菌。这个生物之前被分类为长梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum),也被分类为红褐肉座菌(Hypocreajecorina)。如本文所用，词语“丝状真菌细胞变异菌株”或类似的词语，是指例如通过遗传操作衍自(即得自或可得自)属于盘菌亚门的亲本(或参考)菌株的丝状真菌细胞菌株。如本文所用，术语“目的蛋白”是指想要在丝状真菌中表达的多肽，任选地以高水平且以商业化为目的进行表达。这种蛋白可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋
&坐坐H寸寸ο如本文所用，词语“基本无活性”或类似词语，意思是特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰混合物的预期目的。 如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任意长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母代码或三字母代码。聚合物可为直链的或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可间夹有非氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括(例如)含有氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)的一个或多个类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所用，功能上和/或结构上类似的蛋白质被视为“相关蛋白质”。此类蛋白质可衍自不同属和/或种的生物体、或甚至不同纲的生物体(如，细菌和真菌)。相关蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的或通过免疫交叉反应性确定的同源物。如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指这样的蛋白质，其通过将一个或多个氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸、在该蛋白质的任一端或两端或氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、和/或在该氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍自或可衍自某一蛋白质。蛋白质衍生物的制备可通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、将DNA序列转到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白质来实现。相关的(以及衍生的)蛋白质包括“变异蛋白质”。变异蛋白质不同于参考蛋白质/亲本蛋白质(如野生型蛋白质)之处在于少量氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。变异蛋白质与亲本蛋白质之间的差异氨基酸残基数目可为一个或多个，如1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变异蛋白质与参考蛋白质可享有至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约91%、至少约92 %、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%或更高的氨基酸序列同一性。变异蛋白质还可在选定的基序、结构域、表位、保守区域等方面不同于参考蛋白质。 如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内的提供与目的蛋白质(即，通常是原始目的蛋白质)相似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在包含α -螺旋或β -片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施方案中，开发了类似序列，使得置换氨基酸导致产生显示相似或改进的功能的变异酶。在一些实施方案中，目的蛋白质中氨基酸的三级结构和/或保守残基位于目的区段或片段处或其附近。因此，在目的区段或片段包含(例如)α -螺旋或β -片层结构的情况下，置换氨基酸优选地保持该特定结构。如本文所用，术语“同源蛋白质”是指与参考蛋白质具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不意味着各同源物一定在进化上相关。因此，该术语的意图是涵盖得自不同生物体的相同、相似或相应的酶(即，在结构和功能方面)。在一些实施方案中，希望鉴定与参考蛋白质具有相似的四级结构、三级结构和/或一级结构的同源物。在一些实施方案中，同源蛋白质引起与参考蛋白质相似的免疫应答。在一些实施方案中，同源蛋白质被工程改造以制备具有所需活性的酶。序列之间同源性的程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定(参见如Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:482 (Smith 和 Waterman, 1981 年，《应用数学进展》，第 2 卷,第 482 页)；Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.，48:443 (Needleman和ffunsch, 1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页)；Pearson andLipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 (Pearson 和 Lipman, 1988 年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页)；程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics ComputerGroup, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；和 Devereux et al.(1984)NucleicAcidsRes.12:387-95 (Devereux 等人，1984 年，《核酸研究》，第 12 卷，第 387-395页)。例如，PILEUP是测定序列同源水平的有用程序。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列对比。它还能够绘制显示聚类关系(用于产生比对)的树形图。PILEUP 使用 ·Feng和 Doolittle 的渐进式比对方法(Feng and Doolittle (1987) J.Mol.Evo1.35:351-60 (Feng 和 Doolittle, 1987 年，《分子进化杂志》，第 35 卷，第 351-360 页)的简化版。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似((1989)CAB10S5 =151-53(1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页))。可用的PILEUP参数包括:默认间隙权重3.00、默认间隙长度权重0.10，以及加权末端间隙。可用的算法的另一例子是Altschul 等人((1990) J.Mol.Biol.215:403-10 (1990 年，《分子生物学杂志》，第 215 卷，第 403-410 页))和 Karlin 等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-87(1993 年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5887页))描述的BLAST算法。一种尤其可用的BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序(参见，例如，Altschul et al.(1996)Meth.Enzymol.266:460-80 (Altschul等人，1996年，《酶学方法》，第266卷，第460-480页))。参数“W”、“T”和“X”确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值:字长(W) 1UBL0SUM62记分矩阵(参见，例如 Henikoff and Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))比对(B) 50次、预期(E) 10、M' 5、N' -4，对两条链进行比较。如本文所用，词语“实质上类似”和“实质上相同”，在至少两条核酸或多肽的情况下，通常意味着多核苷酸或多肽包含的序列与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70%的同一性、至少约75%的同一性、至少约80%的同一性、至少约85%的同一性、至少约90%的同一性、至少约91%的同一性、至少约92%的同一性、至少约93%的同一性、至少约94%的同一‘注、至少约95%的同一性、至少约96%的同一‘注、至少约97%的同一性、至少约98%的同一性、或甚至至少约99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL的已知程序，使用标准参数测定。(参见，例如Altschul，etal.(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 (Altschul 等人，1990 年，《分子生物学杂志》，第 215卷，第 403-410 页)；Henikoff etal.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (Henikoff等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)；Karin etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873 (Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873页);以及 Higginsetal.(1988)Gene73:237-244 (Higgins 等人，1988 年，《基因》，第 73 卷，第237-244页))。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索(Pearson et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444-48 (Pearson 等人，1988 年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页))。两种多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因此，例如当一种多肽与第二多肽仅在保守置换上有差异时，这两种多肽实质上相同。两种核酸序列实质上相同的另一个指示是两种分子在严格的条件下(如，在中至高严格性的范围内)彼此杂交。如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在指代编码蛋白质或RNA并指导蛋白质或RNA的表达的核酸时是同义的。丝状真菌繁殖体通常是单倍体，因而单拷贝的特定基因(即单个等位基因)足够赋予特定表型。如本文所用，“野生型”与“天然”基因、蛋白质或菌株，是指在自然界中存在的那些基因、蛋白质或菌株。如本文所用，“基因缺失”是指其从宿主细胞的基因组中移除。当基因包含与基因的编码序列并未紧挨着的控制元件(如增强子元件)时，基因缺失是指缺失掉编码序列以及任选缺失掉相邻启动子和/或终止子序列。如本文所用，“基因破坏”广义上是指在宿主细胞中进行的任何实质上防止细胞产生功能基因产物(如蛋白质)的遗传或化学操作。基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失掉基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或别的调控元件在内，或者诱变上述元件，其中诱变包括置换、插入、缺失、倒位以及其组合和变化，这些突变中的任一者都实质上防止功能基因产物的产生。如本文所用，“遗传操作”是指预选的核酸靶序列的变更，例如使用优先作用在预选核酸序列上的大分子(即酶和/或核酸)进行变更。因此遗传操作不同于化学操作，后者使用小分子来随机影响对非预选的核酸序列的变化。如本文所用，“遗传变更”是指遗传操作导致的细胞DNA变化，不同于化学操作导致的细胞DNA变化。 如本文所用，“有氧发酵”是指有氧气存在下的生长。如本文所用，术语“细胞培养液”统一指液体/深层培养物中的培养基和细胞。如本文所用，术语“细胞团(cell mass)”是指液体/深层培养物中存在的细胞成分(包括完整和裂解细胞)。可用干重或湿重表示细胞团。如本文所用，术语“流变学”是指研究物质变形和流动的物理学分支。如本文所用，“粘度”是液体对机械应力(如剪切应力和拉伸应力)下变形的抗性的量度。在本发明上下文中，粘度是指含有丝状真菌细胞的细胞培养液对机械应力(如由转子/叶轮提供)的抗性。因为细胞培养液粘度难以直接测量，可使用间接测量粘度的方式，例如预选搅拌量下发酵液溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、维持预选溶氧量所需搅拌细胞培养液的功率大小、或甚至固体培养基上的菌落形态。如本文所用，“粘度改变的”丝状真菌细胞变异菌株是指其产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液粘度降低或增加(即对剪切或拉伸应力的抗性降低或增加)的变异菌株。通常，等同的细胞培养液具有类似的细胞团。优选地，粘度改变的变异菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度量度方面的差异为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。用于比较丝状真菌细胞培养液粘度的方法在本文中有描述。通常，类似的(或等同的)细胞培养液具有类似的细胞团。如本文所用，“粘度降低的”丝状真菌细胞变异菌株是指其产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液粘度降低(即对剪切或拉伸应力的抗性降低)的变异菌株。优选地，粘度改变的变异菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度量度方面的差异为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。如本文所用，“主要遗传决定因子”是指在不存在其他基因或其遗传操作的情况下，为赋予特定表型而必需且充分的基因或其遗传操作。如本文所用，“功能多肽/蛋白”是指具有活性例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，且未进行诱变、截短或以其他方式修饰以去除或降低该活性的蛋白质。功能多肽可为耐热性的或不耐热的，如所指明的。如本文所用，“功能基因”是指能够被细胞组分使用以产生活性基因产物(通常是蛋白质)的基因。功能基因与被破坏基因相反，后者被修饰，因此不能被细胞组分使用以产生活性基因产物。如本文所用，相比于亲本细胞(或亲本菌株)，若变异细胞与亲本细胞之间蛋白表达量差异低于约20%、低于约15%、低于约10%、低于约7%、低于约5%、或甚至低于约3%，则变异细胞(或变异菌株)“维持或保持高水平蛋白表达和/或分泌”。如本文所用，若宿主细胞进行了遗传或化学变更以防止产生功能性Sfb3多肽一该多肽具有野生型Sfb3蛋白特有的活性，尤其是促进菌丝延长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌粘度的活性——则宿主细胞已“被修饰`以防止产生Sfb3”。此类修饰包括但不限于sfb3基因缺失、sfb3基因破坏、使所编码的多肽缺乏上述活性的sfb3基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的sfb3基因修饰以及它们的组合。如本文所用，“目的蛋白”是期望在丝状真菌细胞深层培养物中产生的蛋白质。通常，目的蛋白在工业或医药用途方面具有重要商业价值，因此希望大规模生产。要将目的蛋白与丝状真菌细胞表达的大量其他蛋白质区分开，后者通常非目的产物，主要被视为背景蛋白质污染物。如本文所用，若相比于亲本细胞产生的蛋白量，变异细胞产生的蛋白量减少不超过20 %、减少不超过15 %、减少不超过10 %或甚至减少不超过5 %,其中蛋白量被归一化到从中测定蛋白产量的细胞的生物量总量，其中生物量可用湿重(如细胞团块)或干重方式表示，则变异细胞(或变异菌株)每单位量的生物量产生与亲本细胞(或亲本菌株)“实质上相同量”的蛋白质。如本文所用，若变异细胞与亲本细胞之间表达差异低于约20%、低于约15%、低于约10%、低于约5%、低于约4%、低于约3 %、低于约2%或甚至低于约I %，则变异细胞与亲本细胞表达的目的蛋白量“实质上相似”。如本文所用，“荧色物”为荧光染料。优选的荧色物与真菌细胞壁的纤维素和/或几丁质结合。如本文所用，单数词语“一个”、“一种”和“该”涵盖多个指代物，除非上下文明确地另有所指。本文引用的全部参考文献均以引用方式全文并入本文。除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有下列含义:
EC酶学委员会kDa千道尔顿kb千喊基MW分子量w/v重量/体积w/w重量/重量v/V体积/体积Wt %重量百分比V摄氏度H2O水
H2O2过氧化氢dH20或DI去离子水dIH20Mill1-Q过滤的去离子水g 或 gm克μ g微克mg毫克kg千克Ib磅μ L 和 μ I 微升mL 和 ml毫升mm毫米μ m微米M摩尔浓度mM毫摩尔浓度μ M微摩尔浓度U单位ppm份每一百万份sec 和"秒min 和'分钟h小时EtOH乙醇eq.当量N当量的PCR聚合酶链反应DNA脱氧核糖核酸FOA氟乳清酸UV紫外线A540540nm波长处测得的吸光度CMC羧甲基纤维素
rpm转每分钟Δ与缺失相关DO溶解氧 II1.丝状真菌的粘度降低表型之前研发里氏木霉粘度降低菌株的努力涉及化学诱变，然后针对卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性筛选所得的突变体(有时在本文称为“菌株”)，卡尔科弗卢尔荧光增白剂是能结合真菌细胞壁的纤维素和几丁质的荧光染色剂。卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性与酵母形态变化有关，尽管卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性在丝状真菌中的重要性至今尚不清楚。这样，亲本里氏木霉菌株Morph TrglaA (29-9)进行了化学诱变,发现所得的一个菌株(即70H2)在琼脂板上菌落生长率降低，在液体培养基中孢子形成减少、形态改变且粘度降低，但同时保持高水平蛋白表达和分泌。基因组序列比较分析表明，与亲本29-9菌株相t匕，70H2菌株的多个基因发生了突变。虽然70H2菌株表现出“粘度降低”表型，但尚未清晰界定其基因组，不清楚负责粘度降低表型的基因。此外，虽然70H2可用作宿主菌株以引入外源基因进行高水平表达，但不可能将负责粘度降低表型的基因引入到其他菌株中。IV.Sfb3产暈的改变会影响丝状真菌的细胞粘度现已发现Sfb3产量的改变会影响丝状真菌的细胞粘度。这个发现对于使用丝状真菌表达具有商业价值的蛋白质有着重大意义。Sfb3基因(也称为Lstl)之前只在出芽酵母(即酿酒酵母)中得到表征，在出芽酵母中它编码与围绕运输小泡(其将蛋白质从内质网转运到高尔基体)的COPII蛋白外壳缔合的蛋白质。Sfb3和Sfb2是Sec24的同源物，其所有基因参与将特定货物蛋白质包装到小泡中。虽然Sec24是酵母的必需基因，但Sfb3和Sfb2却并不是，尽管已知酵母Sfb3缺失会影响质膜转运蛋白(Pmalp)及参与细胞壁合成的葡聚糖转移酶(Gaslp)的转运。使用酿酒酵母Sec24p、Sfb3p或Sfb2p氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST搜索可公开获得的里氏木霉基因组序列，发现里氏木霉有与酵母Sec24同源性最接近的单个基因及与酵母Sfb3同源性最接近的单个基因。没有鉴定到其他同源物，表明里氏木霉不具有与Sfb2等同的基因。使用里氏木霉Sfb3氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST搜索盘菌亚门的种的可公开获得的基因组序列，证明是一般模式。也就是说，每个真菌都具有Sfb3和Sec24各自的明确同源物，但是与酵母Sfb2相关性更接近的另外同源物并不存在于这些丝状子囊菌的基因组中。在丝状真菌(如里氏木霉和米曲霉)中发现了 Sfb3蛋白的同源物，但这些蛋白质的功能至今尚不清楚。酿酒酵母Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ IDN0:1)、里氏木霉Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0:2)、米曲霉Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0:3)、黑曲霉(A.niger)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO:4)、绳状青霉(P.funiculosum) Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQID NO:5)、产黄青霉(P.chrysogenum) Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:6)、粗糙脉孢菌(N.Crassa) Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:7)、尖孢镰刀菌(F.0xysporum) Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID N0:8)作为示例显示如下:SEQ ID NO:4_8是从可公开访问的真菌基因组数据库获得，但不具有登录号。酿酒酵母Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:1):MSQQNILAASVSALSLDESTVHTGGASSKKSRRPHRAYHNFSSGTVPTLGNSPYTTPQLNQQDGFQQPQAFTPKQFGGFNNGSGSVMSTPVMVSQERFGASEASSPYGQSMLDMTAPQPTSHIVPTQRFEDQAQYLQRSFETCRDSVPPLPTTQFYCVDQGSCDPHLMSLSMYNIPESEHLRAATKLPLGLTIQPFSTLTPNDAEVPTIPLPMDGTPLRCRRCRAYANPKFQFTYDSSVICNICRVKMQVPGEHFAPMGPNGQRSDLNEKSELLHGTVDFLVPSIYNAIQEKELLPLHYVFLIDVSLLANENGSSLAMVEGVRSCIEYISDFQPNCEVAIIVYDNKLRFFNLRPDLDNAQEYIVSELDDVFLPFYNGLFVKPGNSMKIINDTLIKISGYISTDKYSHVPQVCYGSALQAAKLALDTVTGGQGGKIICSLNSLPTIGNGNLSLKRDNAHIAHVKCDNGFYKKLASDFLKSYISLDLYVTNAGFIDMATVGHPVEMTSGILKYYPHFQQETDAFTLVNDMVTNVSNIVGYQALLKVRCSTGLSVEQYYCDSSDNTDHDPIIPVLTRDTTLDVLLKYDSKIKTGTDVHFQTALLYTDIDGVRKVRSINTSGAVSNNIREIFKFINQNPVMRMIKDVIKTL⑶CDFVKIRRLIDDKMVEILTQYRGLVSSNSSTQLILPDSIKTLPAYMLAFEKSELMKPNAQSTRGNERIYDLLKYDSLNSAQLCYKLYPQIVPFHVLLEETDLTFYDANDKLLQINSSSINNLSVRASHSNFINGGCYLIFQGDTIYLWFNENTNRMLLQDLLSVDESLPVSQISLFSGTLPETGTSINQKASNVIKNWQQVVNKSSLPLVLLRPNVDQYYSNVMSQLLCEDKTVNRIESYDNYLVIMHKKIQEKLQKDDFIKVSTAATHENIHQKFVQF里氏木霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:2):MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFM RDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKE⑶GEATAVMANFAGLRPAYW米曲霉RIB40Sfb3 氨基酸序列(G1:83766074 ；SEQ ID NO:3):MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKIFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRETGYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCVVSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYfSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDffLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYff黑曲霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:4)MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWIHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMIVEDRNNEAQS SVDffLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYff绳状青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:5)MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDV⑶LATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKAGDKTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYff
产黄青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NQ:6)MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQ
权利要求
1.种衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，所述变异菌株包含能使所述变异菌株的细胞与所述亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Sfb3蛋白的遗传变更，其中所述变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。
2.据权利要求1所述的变异菌株，其中功能性Sfb3蛋白的所述改变量为减少量，并且所述变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。
3.据权利要求1或2所述的变异菌株，其中所述遗传变更包括破坏所述亲本菌株中存在的所述sfb3基因。
4.据权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是缺失所述sfb3基因的全部或部分所致。
5.据权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是缺失包含所述sfb3基因的基因组DNA的一部分所致。
6.据任何权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是诱变所述sfb3基因所致。
7.据权利要求3至6中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是使用位点特异性重组来进行。
8.据权利要求3至7中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。
9.据权利要求3至8中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是赋予所述变异菌株粘度降低表型的主要遗传决定因子。
10.据权利要求1至9中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株不产生功能性Sfb3蛋白。
11.据权利要求1至9中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株不产生Sfb3蛋白。
12.据权利要求1至11中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。
13.据权利要求1至12中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与所述亲本菌株实质上相同。
14.据权利要求1至13中任一项所述的变异菌株，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列 IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO:9，其中 X 为任何氨基酸残基)。
15.据权利要求1至14中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌是盘菌亚门的种。
16.据权利要求1至15中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌是里氏木霉。
17.种产生丝状真菌细胞变异菌株的方法，包括:将遗传变更引入到丝状真菌细胞亲本菌株中，其中与所述亲本菌株的细胞相比，所述遗传变更会改变功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。
18.据权利要求17所述的方法，其中所述遗传变更会减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液Q)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。
19.据权利要求17或18所述的方法，其中所述遗传变更包括使用遗传操作在亲本丝状真菌细胞中破坏所述sfb3基因。
20.据权利要求17或19所述的方法，其中所述遗传变更包括使用遗传操作在亲本丝状真菌细胞中缺失所述sfb3基因。
21.据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述遗传变更是使用位点特异性基因重组来进行。
22.据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中破坏所述。sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。
23.据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与所述亲本菌株实质上相同。
24.据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL(SEQ ID NO:9，其中 X 为任何氨基酸残基)。
25.据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是盘菌亚门的种。
26.据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是里氏木霉。
27.据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。
28.据权利要求27所述的方法，其中在引入所述会减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生的遗传变更之前，编码所述目的蛋白的所述基因存在于所述亲本菌株中。
29.种目的蛋白，所述目的蛋白由根据权利要求12或13所述的变异菌株产生。
30.种丝状真菌变异菌株，所述丝状真菌变异菌株通过根据权利要求17至28中任一项所述的方法产生。
31.种衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，所述变异菌株包含: (a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量，和 (b)编码目的蛋白的基因， 其中编码所述目的蛋白的所述基因在(a)中所述遗传变更之前存在于所述变异菌株中。
32.据权利要求31所述的变异菌株，其中所述遗传变更包括破坏所述亲本菌株中存在的所述sfb3基因。
33.据权利要求31中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。
34.种针对粘度改变表型筛选变异丝状真菌细胞的方法，包括:(a)诱变所述丝状真菌亲本菌株的细胞以产生变异细胞； (b)针对改变的荧光染色剂敏感性筛选所述变异细胞；以及 (C)选择对所述荧光染色剂敏感性改变的所述变异细胞； 其中，对所述荧光染色剂的敏感性改变与所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的能力有关，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相t匕，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。
35.据权利要求34所述的方法，其中所述敏感性改变是指敏感性增加，并且所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。
36.据权利要求34或35所述的方法，其中所述荧光染色剂是卡尔科弗卢尔荧光增白剂。
37.据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中诱变所述细胞通过基因重组来进行。
38.据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中诱变所述细胞是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。
39.种鉴定盘菌亚门丝状 真菌的种中的sfb3多肽的方法，包括: (a)从盘菌亚门丝状真菌的种获得氨基酸序列；以及 (b)针对连续氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ IDNO:9，其中 X为任何氨基酸残基)的存在筛选所述氨基酸序列； (c)其中SEQID NO:9在来自所述盘菌亚门丝状真菌的种的所述氨基酸序列中的存在表明来自所述盘菌亚门丝状真菌的种的所述氨基酸序列是sfb3多肽。
40.种通过根据权利要求39所述的方法鉴定的分离sfb3多肽。
41.种在丝状真菌细胞中产生目的蛋白的方法，包括:将编码所述目的蛋白的基因以及可减少所述细胞中Sfb3蛋白的量或活性的遗传变更引入到亲本丝状真菌细胞中，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生包含所述目的蛋白的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量，并且其中所述目的蛋白在所述变异细胞中与所述亲本细胞相比，以实质上相同的水平产生。
42.据权利要求41所述的方法，其中所述目的蛋白为超过一种目的蛋白，并且所述超过一种目的蛋白中的每种在所述变异细胞中与所述亲本细胞相比，以实质上相同的相对水平产生。
43.据权利要求42所述的方法，其中所述超过一种目的蛋白选自纤维素酶和半纤维素酶。
44.种通过根据权利要求41至43中任一项所述的方法生产的目的蛋白。
45.种组合物，其包含通过根据权利要求42至43中任一项所述的方法生产的超过一种目的蛋白。
46.据权利要求45 中所述的组合物，其中所述组合物为全纤维素酶组合物。
全文摘要
本发明描述了与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。此类变异株非常适于在深层培养物中生长，例如用于大规模生产供商业应用的酶和其他蛋白质。
文档编号C12N15/31GK103097536SQ201180040997
公开日2013年5月8日 申请日期2011年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者T·C·道奇, A·维拉格, M·华德 申请人:丹尼斯科美国公司