热稳定性木霉属纤维素酶的制作方法

热稳定性木霉属纤维素酶的制作方法
【专利摘要】本发明描述涉及热稳定性真菌纤维素酶EGV的组合物和方法，以及具有修饰的木霉属宿主细胞，该修饰包含用于这个纤维素的表达的核苷酸的中断或者缺失或者实质上由该中断或者缺失组成，由此EGV表达得到防止。
【专利说明】热稳定性木霉属纤维素酶
[0001]以引用方式并入本文
[0002]本申请要求2010年10月20日提交的系列号为61/394，946的美国临时申请和2010年10月20日提交的第10188285.0号欧洲专利申请的优先权。
[0003] 前述申请，以及其中引证的或者在它们审查过程中引证的所有文件(“申请引证文件”)以及申请引证文件中引证或者参考的所有文件，以及本文引证或者参考的所有文件(“本文引证文件”)以及本文引证文件中引证或者参考的所有文件，还有关于在本文中或者在以引用方式并入本文的任何文件中提到的任何产品的任何生产商说明书、描述、产品规格和产品单，都以引用方式并入本文，并且可应用于本发明的实施。
【技术领域】
[0004]本发明涉及具有这样的修饰的木霉属(Trichoderma)例如里氏木霉(T.reesei)宿主细胞，该修饰包含据以防止或者减少热稳定性真菌纤维素酶(例如内切葡聚糖酶V(EGV))的表达的中断或者缺失,或者该修饰实质上由该中断或者缺失组成，比如,具有这样的修饰的木霉属例如里氏木霉宿主细胞，该修饰包含参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断，或者该修饰实质上由该缺失或者中断组成，该修饰例如是这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失。这种宿主细胞特别可用于表达不含不需要的纤维素酶活性的热稳定性多肽。本发明有利地涉及包含和表达这样的外源核酸分子的木霉属例如里氏木霉，该核酸编码目的蛋白，例如编码疏水蛋白(例如疏水蛋白II)，并具有这样的修饰，该修饰包含参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断，或者该修饰实质上由该缺失或者中断组成，由此目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)得到表达，而EGV表达被防止或者减少。例如，该木霉属修饰可实质上由egl5的缺失或者中断组成。
【背景技术】
[0005]纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶类的微生物(例如细菌、酵母和真菌)降解和用作能源(Aro 等人，(2001)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，276:24309-14)。
[0006]纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或者β-D-糖苷键)而导致葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的形成的酶类。传统上将纤维素酶分为三大类:内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4) ( “EG”)、外切葡聚糖酶或者纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91; “CBH”)和β -葡糖苷酶(β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21 ;“BG”) (Knowles 等人，(1987)，TIBTECH5:255-61 ;以及 Schulein，(1988)，《酶学方法》(Methods Enzymol.)，160:234-43)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，以水解低结晶度区域中的内部β -1, 4-糖苷键。纤维二糖水解酶从纤维素的还原端或者非还原端水解纤维二糖，并且能够降解结晶纤维素(Nevalainen 和 Penttila, (1995),《真菌界》(Mycota), 303-319)。纤维二糖水解酶(CBH)在纤维素酶系统中的存在据认为是结晶纤维素的有效溶解所需(Suurnakki等人，(2000)，《纤维素》Cellulose，7:189-209)。β -葡糖苷酶起到从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单元的作用(Freer, (1993),《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),268:9337-42)。β -葡糖苷酶还已被证实能催化水解烷基和/或芳基β -D-葡萄糖苷如甲基β -D-葡萄糖苷和对硝基苯基葡萄糖苷以及仅含碳水化合物残基的糖苷如纤维二糖。[0007]已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌能产生包括外切纤维二糖水解酶或者说CBH型纤维素酶、内切葡聚糖酶或者说EG型纤维素酶和β -葡糖苷酶或者说BG型纤维素酶的完全纤维素酶系统。其他真菌和细菌极少表达或者不表达CBH型纤维素酶。里氏木霉(也称红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))能表达大量的纤维素酶，包括两种 CBH,即 CBHI (Ce17a)和 CBHII (Cel6a)，至少八种 EG,即 EGI (Cel7b)、EGII(CeI5a)、EGIII(Cel12a)、EGIV(Cel61a)、EGV(Cel45a),EGVI(CeI74a)、EGVII(Cel61b)和 EGVIII (Cel5b)，和至少五种 BG,即 BGl (Ce13a)、BG2 (Celia)、BG3 (Cel3b)、BG4 (Cel3c)和BG5 (Cellb)。EGIV、EGVI和EGVIII还具有木葡聚糖酶活性。
[0008]在一些情况中，希望使用从里氏木霉获得的全纤维素酶培养液作为纤维素酶来源，例如用于生物质转化、纺织品加工、纸张和纸浆处理等。在其他情况中，里氏木霉用作表达经工程改造的纤维素酶、来自其他生物体的纤维素酶或者另外的酶类或者纯粹其他蛋白质(例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、结构蛋白等)的优良宿主生物。尤其是在后面这些情况中，可能希望在内源里氏木霉纤维素酶不存在下表达目的蛋白。虽然这可通过缺失内源里氏木霉纤维素酶基因来实现，但由于这些基因为数众多，使得这种方案费时耗力。
[0009]在本申请中引证或者确认任何文件并不是承认这种文件可作为本发明的现有技术利用。

【发明内容】

[0010]本发明提供与木霉属例如里氏木霉中存在的热稳定性纤维素酶有关的组合物和方法，所述组合物例如经修饰的细胞，包括那种经工程改造以表达目的蛋白如疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的细胞。
[0011]在一个方面，本发明提供这样的木霉属例如里氏木霉宿主细胞，其包含据以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生的修饰，或者实质上由该修饰组成。
[0012]在又一个方面，本发明提供这样的木霉属例如里氏木霉宿主细胞，其包含据以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生的修饰，或者实质上由该修饰组成，其中该修饰实质上由参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断组成，例如这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失。
[0013]在其中一个实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含据以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生的修饰，或者实质上由该修饰组成，其中该修饰包含egl5的缺失或者中断或者实质上由该缺失或者中断组成。
[0014]在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含被中断的egl5或者实质上由被中断的egl5组成。
[0015]在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含被缺失的egl5或者实质上由被缺失的egl5组成。[0016]在具体的实施例中，egl5通过同源重组进行缺失。它还可通过同源重组进行中断。
[0017]在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞通过对包含功能性egl5的亲本宿主细胞进行修饰来产生。
[0018]在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含一个或者多个编码热不稳定性酶而使该热不稳定性酶得以表达的内源功能性基因或者核酸分子，或者实质上由所述内源功能性基因或者核酸分子组成；例如该热不稳定性酶可以是纤维素酶、半纤维素酶或者蛋白酶或者这些酶中的任何两种或者所有三种。在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉可表达一种或者多种另外的蛋白质，其可以是外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或者β-葡糖苷酶或者这些蛋白质中的任何两种或者所有三种。
[0019]在一些实施例中，木霉属例如里氏木霉宿主细胞还包含功能性目的基因或者编码目的蛋白且让目的蛋白表达的核苷酸。 [0020]在一些实施例中，目的基因编码或者目的蛋白是热稳定性多肽；例如疏水蛋白，如疏水蛋白II。
[0021]在另一个方面，本发明提供在木霉属例如里氏木霉宿主细胞中产生热稳定性目的蛋白的方法，该方法包括:将编码热稳定性目的蛋白的核酸分子在目的蛋白据以进行体内表达的条件下引入到木霉属例如里氏木霉宿主细胞中，例如其中目的核酸分子有效连接到用于表达的启动子或者调节元件；且其中木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含据以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生的修饰或者实质上由该修饰组成，其中该修饰实质上由参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断组成，例如这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失；例如，其中该修饰包含egl5的缺失或者中断或者实质上由egl5的缺失或者中断组成。热稳定性目的蛋白可以是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。该木霉属例如里氏木霉可另外包含一个或者多个编码另外的功能性蛋白的基因或者一个或者多个编码另外的功能性蛋白的核酸分子，其处于该一个或者多个另外的功能性蛋白据以进行体内表达的条件下，例如其中该一个或者多个核酸分子有效连接到用于表达的启动子和/或调节元件。该方法还可包括使该细胞的表达产物一包括目的蛋白和任何表达在表达产物中的另外的功能性蛋白在内一经历足以显著地灭活所述另外的蛋白质的高温；其中该高温不足以灭活热稳定性目的蛋白且会不足以灭活EGV纤维素酶；其中热稳定性目的蛋白得以以活性或者功能形式产生，而基本上不存在来自所述另外的蛋白质的活性。
[0022]在另一个方面，本发明提供产生热稳定性目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的方法，所述方法包括:使从木霉属例如里氏木霉宿主细胞获得的表达产物经历高温，其中:木霉属例如里氏木霉宿主细胞包含据以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生的修饰或者实质上由该修饰组成，其中该修饰实质上由参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断组成，例如这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失；例如，其中该修饰包含egl5的缺失或者中断或者实质上由egl5的缺失或者中断组成；并且木霉属例如里氏木霉可另外包含一个或者多个编码另外的功能性蛋白的基因或者一个或者多个编码另外的功能性蛋白的核酸分子，其处于该一个或者多个另外的功能性蛋白据以进行体内表达的条件下，例如其中该一个或者多个核酸分子有效连接到用于表达的启动子和/或调节元件；其中该高温足以灭活该一种或者多种另外的功能性蛋白(如果存在的话)，但不足以灭活热稳定性目的蛋白或者EGV ;由此产生出活性或者功能形式的热稳定性目的蛋白，而不存在来自所述另外的功能性蛋白的活性。
[0023]前述方法可另外包括将经修饰的木霉属例如里氏木霉宿主细胞在适合产生目的蛋白质和另外的功能性蛋白(如果存在的话)的培养基中进行温育。
[0024]前述方法还可包括在使目的蛋白和另外的功能性蛋白(如果存在的话)经历高温之前，从经修饰的木霉属例如里氏木霉宿主细胞分离表达产物(或者蛋白质混合物)。
[0025]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，在本来会天然包含egl5的宿主细胞中中断掉egl5。
[0026]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，在本来天然包含egl5的宿主细胞中缺失掉egl5。
[0027]因此，在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，被中断或者缺失的egl5是内源的。
[0028]因此，所述方法可另外包括缺失或者中断egl5或者以别的方式修饰木霉属例如里氏木霉，以显著地减少或者防止热稳定性EGV多肽的产生，其中该修饰实质上由参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断组成，例如这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失。
[0029]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，egl5通过同源重组进行缺失。它还可通过同源重组进行中断。
[0030]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，所述一种或者多种另外的蛋白质是热不稳定性蛋白。在一些实施例中，所述一种或者多种另外的蛋白质可以是纤维素酶、半纤维素酶或者蛋白酶或者这些酶中的任何两种或者所有三种。在一些实施例中，所述一种或者多种另外的蛋白质可以是外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或者β -葡糖苷酶或者这些蛋白质中的任何两种或者所有三种。
[0031 ] 在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，目的蛋白由于可逆地可热变性从而是热稳定的。
[0032]在任何所述方法的情况中，在具体的实施例中，目的蛋白是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。
[0033]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，高温是90 V或者更高的温度。在一个有利的实施例中，高温可以小于约100°c。
[0034]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，暴露于高温达5分钟或者更长的时间。
[0035]在任何所述方法的情况中，在一些实施例中，暴露于高温达60分钟或者更长的时间。
[0036]在又一个方面，提供通过任何这些方法产生的热稳定性或者可逆地可热变性蛋白。
[0037]在一个相关方面，本发明提供从丝状真菌宿主细胞例如木霉属(例如里氏木霉)获得并包含疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的发酵液组合物，其中该发酵液基本上不含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性。例如，从任何前述方法获得或者可从任何前述方法获得的基本上不含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性的发酵液。因此，在一些实施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在热不稳定性纤维素酶和/或甘露聚糖酶的存在下产生，并经历高温以灭活纤维素酶和/或甘露聚糖酶多肽。
[0038]在一些实施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在这样的宿主细胞如木霉属(例如里氏木霉)中产生，该宿主细胞包含据以显著地减少或者防止纤维素酶和/或甘露聚糖酶的产生的修饰或者实质上由该修饰组成，其中该修饰实质上由参与纤维素酶和/或甘露聚糖酶的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断组成，例如纤维素酶和/或甘露聚糖酶的编码基因或者编码区或者用于纤维素酶和/或甘露聚糖酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失，由此从产生该疏水蛋白得到(并含有该疏水蛋白)的发酵液基本上不含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0039]在一些实施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在这样的宿主细胞如木霉属(例如里氏木霉)中产生，该宿主细胞包含据以使宿主细胞缺乏编码纤维素酶和/或甘露聚糖酶的基因或者核酸分子的修饰或者实质上由该修饰组成，由此从产生该疏水蛋白得到(并含有该疏水蛋白)的发酵液基本上不含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0040]在发酵液实施例中，发酵液可进行浓缩，且还可包含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性以外的多种宿主细胞蛋白质。
[0041]在任何本发明实施例中，目的多肽可以是热稳定的、热敏感的或者热不稳定的。
[0042]本发明方法还涉及控制由本发明的经修饰的木霉属宿主细胞表达的目的多肽的活性，其中该目的多肽是热敏感的或者热不稳定的，其中所述方法可包括使热敏感性或者热不稳定性目的多肽以及内源多肽经历高温，其中该高温可足以灭活该内源多肽或者该热敏感性或者热不稳定性多肽。在一个有利的实施例中，内源多肽可以是纤维素酶。所述方法还可包括在使热敏感性或者热 不稳定性目的多肽经历高温之前，使该目的多肽与该目的多肽能够对其起作用的化合物接触。所述方法还可包括在使热敏感性或者热不稳定性目的多肽经历高温之前，使该目的多肽与纤维素酶和该目的多肽能够对其起作用的一种或者多种化合物接触。
[0043]本发明方法还涉及控制本发明的发酵液中的目的多肽的活性的方法，其中该目的多肽可以是热敏感的或者热不稳定的，其中所述方法可包括使发酵液经历足以灭活内源多肽和热敏感性或者热不稳定性多肽的高温。在一个有利的实施例中，内源多肽可以是纤维素酶。所述方法还可包括在使发酵液经历高温之前，使发酵液与目的多肽能够对其起作用的化合物接触。所述方法还可包括在使发酵液经历高温之前，使发酵液与纤维素酶和目的多肽能够对其起作用的一种或者多种化合物接触。
[0044]本发明还涉及控制从经修饰的木霉属宿主细胞获得的组合物中存在的纤维素酶的活性的方法，其中该组合物可包含至少一种EGV之外的纤维素酶，且所述方法可包括使该组合物经历足以灭活目的多肽的高温，并且其中在使该组合物经历高温后该组合物基本上不含纤维素酶活性。目的多肽可以是热敏感的或者热不稳定的。在另一个实施例中，该多肽可以是耐热的或者热稳定的。使该组合物经历高温可在食品或者饮料中进行。在另一个实施例中，高温可为小于约100°C。在另一个实施例中，从经修饰的木霉属宿主细胞获得的组合物可以是包含疏水蛋白的发酵液。
[0045]因此，本发明的一个目标是不将任何之前知道的产品、制造该产品的工艺或者使用该产品的方法涵盖在本发明内，从而本 申请人:保留权利并据此公开对任何之前知道的产品、工艺或者方法的弃权。还要指出，本发明不旨在将任何不符合美国专利商标局(USPTO)(美国法典第35卷第112条(35USC § 112)，第一段)或者欧洲专利局(EPO)(欧洲专利公约(EPC)第83条)的书面说明要求和可实施性要求的产品、制造该产品的工艺或者使用该产品的方法涵盖在本发明的范围内，从而本 申请人:保留权利并据此公开对任何之前描述的产品、制造该产品的工艺或者使用该产品的方法的弃权。
[0046]应指出，在本公开说明书中特别是在权利要求书和/或段落中，术语“包含”(各种语法形式)可具有美国专利法中赋予它的含义；例如，它可以意指“包括”(各种语法形式)；而术语“实质上由…组成”(各种语法形式)具有美国专利法中赋予它的含义，例如它允许没有明确叙及的要素，但排除在现有技术中存在的要素或者影响本发明的基本特征或者新特征的要素。
[0047]术语“实质上由…组成”(各种语法形式)旨在具体避免权利要求指示(read on)现有技术所公开或者提示的各单独实施例或者其任何组合，因为已出乎意料地发现，参与EGV的表达的核苷酸中的缺失或者中断，例如这个纤维素酶的编码基因或者编码区的中断或者缺失，如egl5的缺失或者中断，有助于热稳定性外源多肽例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的表达和/或获得。
[0048]这些和其他的实施例由以下“【具体实施方式】”(包括附图在内)公开，或者从以下“【具体实施方式】”(包括附图在内)显而易见并被其所涵盖。
【专利附图】

【附图说明】
[0049]下文以举例方式给出、但不旨在使本发明仅局限于所描述的具体实施例的“【具体实施方式】”可以结合附图得到最好的理解，附图中:
[0050]图1 是 pFl (EG5RPyr)的质粒图。
`[0051]图2是在中断egl5后里氏木霉染色体的一部分的图谱。
[0052]图3的图象显示经过和不经过热处理的对照里氏木霉培养物和缺失了 egl5的里氏木霉培养物的上清液中存在的纤维素酶活性的量。
[0053]图4的图象显示葡萄糖标准曲线。
[0054]图5的图象显示相比于对照菌株，来自AEG5菌株的上清液中热稳定性纤维素酶活性失去。
[0055]图6是在中断egl5和切除pyr2标志后里氏木霉染色体的一部分的图谱。
[0056]图7是携带与己糖激酶启动子融合的sucA基因的片段的3.5kb DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0057]图8是pFIX，的核苷酸序列，pFIX,是包含来自pUC19的复制起点和氨苄青霉素抗性基因以及噬菌体fl复制起点的小质粒(SEQ ID N0:2)。
[0058]图9由图9A和9B构成，是基于egl5基因和pyr2基因的已知染色体DNA序列推导出的经中断的基因(即“中断盒”)的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。
[0059]图10 是 egl5 的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)。
[0060]图11是EGV的氨基酸序列(SEQ ID NO: 33)。
[0061]图12是载体PTrex3gM(Hfb2)和pTrex8R(Hfb2)的功能性和部分限制图谱。[0062]图13A是pTrex3gM(Hfb2)的核苷酸序列。
[0063]图13B是pTrex8R(Hfb2)的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0064]在详细描述本发明组合物和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语应当被赋予其在相关领域中使用的普通含义。
[0065]本文所用的“纤维素酶”是从纤维素水解β-1，4_葡聚糖或者β-D-糖苷键而导致例如葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖的形成的酶。纤维素酶包含例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶等。
[0066]本文所用的“内切葡聚糖酶(EG) ”是主要作用于纤维素纤维的无定形部分以水解低结晶度区域中的内部β -1, 4-糖苷键的纤维素酶。
[0067]本文所用的术语“半纤维素酶”和“木聚糖酶”可互换使用，通指能够水解包含5碳糖的多糖中的糖苷键的酶。这种酶包含例如甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶等。
[0068]本文所用的里氏木霉(Trichoderma reesei或者T.reesei)指子囊菌门的一种丝状真菌。这种生物之前称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。
[0069]本文所用的词语“里氏木霉EGV纤维素酶”指具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽或者相关多肽。 相关多肽与SEQ ID NO: 33具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或者甚至至少约99%或者更高的氨基酸序列同一性，对纤维素底物具有内切葡聚糖酶活性，并且使用本文描述的测定法测出是热稳定的。“EGV”在本文中可称为“EG5”。
[0070]本文使用的词语“里氏木霉egl5基因”或者“egl5”指编码本文描述的EGV纤维素酶或者相关多肽的核酸。示例性的egl5的核苷酸序列以SEQ ID NO:32显示。EGV的氨基酸序列在SEQ ID N0:33中显示。
[0071]本文使用的关于多肽的术语“热稳定的(热稳定性)”，指多肽在经历预选的高温达预选的一段时间后能够保持生物活性。生物活性可以是该多肽的酶活性、结合活性、表面活性性质或者任何其他活性或者性质特征。如果多肽在暴露于预选的高温达预选的一段时间后保持其原始活性的至少一半，则认为它是热稳定的。广义上讲，预选的温度和时间是为显著地灭活EGV之外的里氏木霉纤维素酶所需的温度和时间。这些条件可容易地通过测定包含egl5缺失或者实质上由egl5缺失组成的里氏木霉宿主细胞中的纤维素酶活性来确立。
[0072]在一些情况中，如果蛋白质在暴露于至少约70°C、至少约75°C、至少约80°C、至少约85°C、至少约90°C或者甚至至少约95°C的温度达至少约3分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟或者甚至至少约60分钟的时间后保持其生物活性的至少一半(即至少50%)，则认为它是热稳定的。在一个例子中，预选温度为约90°C或者更高，预选时间为约5分钟或者更长。在另一个例子中，预选温度为约90°C或者更高，预选时间为约60分钟或者更长。热稳定性多肽包含在高温下可逆地变性，使得在所描述的暴露之后恢复其生物活性的至少一半(即至少50%)的多肽。
[0073]本文使用的关于多肽的术语“热不稳定的(热不稳定性)”和“非热稳定的(非热稳定性)”可互换使用，指多肽在经历预选的高温达预选的一段时间后不能够保持生物活性。生物活性可以是该多肽的酶活性、结合活性、表面活性性质或者任何其他活性或者性质特征。多肽如果在暴露于预选的高温达预选的一段时间之后失去其原始活性的至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或者甚至几乎100%，则认为它是热不稳定的。这种温度和时间刚刚在上文描述，以及在本说明书中别处描述。对热不稳定性多肽的数目或者类型没有限制。例子包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶、过水解酶、植酸酶、漆酶以及其他商业上相关的酶、结合蛋白和结构蛋白。
[0074]本文所用的词语“目的蛋白”指需要在里氏木霉中表达的EGV之外的多肽。这种蛋白可以是酶、结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等。目的蛋白可以是热稳定的或者热不稳定的。在指明的情况下，它是热稳定的。
[0075]本文所用的词语“基本上无活性”(或者类似词语)意思是，指定的活性要么在多肽混合物中不可检测到，要么以不会干扰该混合物的预定用途的量存在。
[0076]本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母密码或三字母密码。聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可间夹有非氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括(例如)包含一个或多个氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)类似物的多肽，以及本领域中已知的其他修改形式。
[0077]如本文所用，功能上和/或结构上相似的蛋白质认为是“相关蛋白”。这种蛋白质可衍自另外属和/或种的生物，或者甚至另外类别的生物(例如细菌和真菌)。相关蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的或通过免疫交叉反应性确定的同源物。
[0078]本文所用的术语“衍生的多肽/蛋白质”是指这样的蛋白质，其通过将一个或多个氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸`序列中的一个或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸、在该蛋白质的一端或两端或者氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、和/或在该氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自另一蛋白质。制备蛋白质衍生物可通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、将DNA序列转到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白质而实现。
[0079]相关(以及衍生的)蛋白质包括“变体蛋白质”。变体蛋白质由于置换、缺失和/或插入少量的氨基酸残基而不同于参考蛋白质/亲本蛋白质，例如野生型蛋白质。不同的氨基酸残基的数量可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白质与参考蛋白质享有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%或更高的氨基酸序列同一性。变体蛋白质还可在所选的基序、结构域、表位、保守性区域等方面不同于参考蛋白质。
[0080]本文所用的术语“类似序列”指蛋白质内的提供与目的蛋白(即，通常是原始目的蛋白)相似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在包含α -螺旋或β -片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。所述术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发了类似序列，使得置换氨基酸导致变体酶显示相似或改进的功能。在一些实施例中，所关注蛋白质中氨基酸的三级结构和/或保守性残基位于目的区段或片段处或其附近。因此，在目的区段或片段包含(例如)α-螺旋或β -片层结构的情况下，置换氨基酸优选地保持该特定结构。
[0081]本文所用的术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似的活性和/或结构的蛋白质。这并不意味着各同源物一定在进化上相关因此，该术语的意图是涵盖得自不同生物体的相同、相似或相应的酶(即，在结构和功能方面)。在一些实施例中，很希望识别与参考蛋白质具有相似的四级结构、三级结构和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白质引起与参考蛋白质相似的免疫应答。在一些实施例中，工程构造出同源蛋白质以制备具有所需活性的酶。
[0082]序列之间同源性的程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定(参见例如Smith 和 Waterman, (1981)，《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.) ,2:482 ；Needleman 和ffunsch, (1970),《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.), 48:443 ;Pearson 和 Lipman, (1988),《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444 ;程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；以及Devereux 等人,(1984),《核酸研究》(Nucleic Acids Res.), 12:387-395)。
[0083]例如，PILEUP是可用于测定序列同源程度的程序。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列对比。其还能够绘制显示聚类关系(用于产生比对)的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(参见Feng和Doolittle, (1987),《分子进化学杂志》(J.Mol.Evol.)，35: 351-360)。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似(Higgins和Sharp， 1989年，《计算机在生物科学中的应用》(CABIOS)，5:151-153)。可用的PILEUP参数包括:默认间隙权重3.00、默认间隙长度权重0.10，以及加权末端间隙。可用的算法的另一例子是Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，(1990),《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，215:403-410 ;以及Karlin等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5787)。一种尤其可用的 BLAST 程序是WU-BLAST-2 程序(参见 Altschul 等人，(1996)，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，266:460-480)。参数 “W”、“T”和“X”确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值:字长(W)为11，BL0SUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915)比对(B)为50，期望值(E) % 10,Mi 5，N' _4，以及对两条链的比较。
[0084]本文所用的词语“基本上相似”和“基本上相同”，在至少两个核酸或者多肽的情形中，通常意指多核苷酸或者多肽包含与参考(即野生型)序列相比具有至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一^丨生、至少约92%同一‘丨生、至少约93%同一‘丨生、至少约94%同一‘丨生、至少约95%同一‘丨生、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性、或者甚至至少约99%或者更高的同一性的序列。序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。(参见例如Altschul等人，(1990)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.) ,215:403-410 ；Henikoff 等人，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA), 89:10915 ；Karin等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90:5873 ;以及Higgins等人，(1988)，《基因》(Gene) ,73:237-244)。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索(Pearson等人，(1988),《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444-2448)。两条多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因此，一种多肽与第二多肽实质上一致，例如，在此情况下两个多肽仅因保守置换而不同。两种核酸序列实质上一致的另一个指示是两种分子在严格的条件(例如，在中至高严格度的范围内)下彼此杂交。
[0085]本文所用的“野生 型”和“天然”基因或者蛋白质是那些在自然界中存在的基因或者蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因/蛋白质”在本文中互换使用，指天然的或天然存在于宿主细胞中的序列。
[0086]本文所用的“基因缺失”指基因从宿主细胞的基因组中移除。
[0087]本文所用的“基因中断”广义上指任何能极大地防止功能性基因产物(例如蛋白质)在宿主细胞中的表达的遗传操作或化学操作。示例性的中断方法包括完全或部分缺失掉基因的任何部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或者别的调节元件在内，或者诱变它们(包括置换、插入、缺失及其组合在内)，以极大地防止功能性基因产物的表达。
[0088]本文所用的“功能性基因”是能够被细胞组分使用以产生活性基因产物(通常是蛋白质)的基因。“功能性基因”与“被中断基因”相反，后者被修饰，使得它们不能被细胞组分使用以产生活性基因产物。示例性的功能性基因包括但不限于EGV之外的纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、过水解酶、酯酶、果胶酸裂解酶、果胶酶、漆酶、氧化酶、还原酶、酰胺酶以及其他酶类、结构蛋白、表面活性蛋白、结合蛋白等。
[0089]如本文所用，里氏木霉宿主细胞如果已被遗传变更或者化学变更以防止表现出热稳定性纤维素酶活性(例如使用本文描述的测定法测定)的EGV多肽的产生，则它们“已被修饰以防止热稳定性EGV纤维素酶的产生”。这种修饰包括但不限于对egl5进行的缺失、对egl5进行的中断、对egl5进行的使得所编码的EGV多肽不再热稳定的修饰、对egl5进行的使得所编码的EGV多肽不再表现出纤维素酶活性的修饰、对egl5进行的使得所编码的EGV多肽不再被分泌的修饰、对启动子或者调节元件进行的使得EGV不被表达的修饰，以及它们的组合。
[0090]本文所用的“功能多肽/蛋白”是这样的蛋白质，其具有活性如酶活性、结合活性、表面活性性质等，且未被诱变、截短或以其他方式修饰以去除(或者实质上消除)该活性。如所指明，功能多肽可以是热稳定的或者热不稳定的。
[0091]本文所用的“不想要的活性”是在从里氏木霉宿主细胞产生的蛋白质制品中不需要的活性(例如酶活性、结合活性、表面活性性质等)。不想要的活性通常在还包含具有所需的或者合乎需要的活性的目的蛋白的蛋白质制品中出现。
[0092]本文所用的“发酵液组合物”指含有目的蛋白如疏水蛋白的细胞生长培养基。细胞生长培养基可包括细胞和/或细胞碎片，且可以进行浓缩。示例性的发酵液组合物是含疏水蛋白的经超滤浓缩的发酵液。
[0093]本文所用的“甘露聚糖酶甘露糖单位(MMU) ”，是在0.24%刺槐豆胶(LBG)存在下在pH 7.0和50°C下每分钟产生I微摩尔的还原端对等物(包括但不限于D-甘露糖)所需的甘露聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0094]本文所用的“内切葡聚糖酶单位(EGU) ”是每分钟产生I微摩尔的还原糖所需的内切葡聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0095]本文所用的“蛋白酶单位(PU) ”对应于在pH 6.2和25 °C下每分钟水解I微摩尔的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)所需的半胱氨酸蛋白酶量每毫克疏水蛋白。
[0096]本文所用的“处理”食品或者其他材料以在该材料中实现变化，意思是使该食品或者其他材料与从里氏木霉宿主细胞产生的蛋白质制品接触，其中该蛋白质制品中存在的一种或者多种蛋白质作用于该食品或者其他材料的组分，以由于例如酶活性、结合活性、表面活性性质等而引起化学变化。处理的例子包括使焙烤食品制品接触淀粉酶以水解支链淀粉、使食品制品接触脂肪酶以产生乳化剂和使食品制品接触疏水蛋白以改变质构。
[0097]本文所用的单数名词涵盖多个指代物，除非上下文明确地表明并非如此。本文引用的全部参考文献均以引用方式全文并入本文。 [0098]除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有下列含义:
[0099]
【权利要求】
1.一种木霉属宿主细胞，其包含: 修饰，其中所述修饰显著地减少或者防止所述木霉属宿主细胞产生热稳定性内切葡聚糖酶 V (EGV)， 与启动子有效连接的编码目的多肽的外源目的核酸分子，所述启动子使得至少一种内源多肽和所述目的多肽各自被所述木霉属宿主细胞体内表达。
2.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞，其中所述修饰在参与EGV的表达的核苷酸中包含一个或者多个缺失或者中断。
3.根据权利要求2所述的木霉属宿主细胞，其中所述中断或者缺失包含EGV编码基因或者编码区或者用于EGV的表达的启动子或者调节元件的缺失或者中断。
4.根据权利要求3所述的木霉属宿主细胞，其中所述缺失或者中断包含egl5的缺失或者中断。
5.根据权利要求4所述的木霉属宿主细胞，其中所述缺失或者中断包含egl5中断。
6.根据权利要求4所述的木霉属宿主细胞，其中所述缺失或者中断包含egl5缺失。
7.根据权利要求6所述的木霉属宿主细胞，其中egl5通过同源重组进行缺失。
8.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞，其中所述内源多肽包含纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶或者它们的组合。
9.根据权利要求8所述的木霉属宿主细胞，其中所述热不稳定性酶包含纤维素酶或者半纤维素酶。`
10.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞,其中所述木霉属是里氏木霉。
11.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
12.根据权利要求10所述的木霉属宿主细胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
13.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞，其中所述目的多肽是热稳定的。
14.根据权利要求1所述的木霉属宿主细胞，其中所述目的多肽是热敏感的或者热不稳定的。
15.一种在根据权利要求1-12中任一项所述的经修饰的木霉属宿主细胞中制备所述目的多肽的方法，其中所述目的多肽是热稳定的，所述方法包括: 将所述经修饰的宿主细胞在适合于所述经修饰的宿主细胞的培养基中进行温育以产生所述热稳定性目的多肽和所述内源多肽，由此所述内源多肽和所述热稳定性目的多肽各自被所述经修饰的宿主细胞表达；以及 使所述热稳定性目的多肽和所述内源多肽经历高温， 其中所述高温足以显著地灭活所述内源多肽，但不足以灭活所述热稳定性目的多肽和EGV，如果它存在的话； 由此所述热稳定性目的多肽得以以活性或者功能形式产生，而基本上不存在来自所述内源多肽的活性。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括在将所述目的多肽和所述内源多肽经历所述高温的步骤之前从所述经修饰的木霉属宿主细胞分离蛋白质混合物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述经修饰的宿主细胞表达外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶或者它们的组合。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述热稳定性目的多肽是可逆地可热变性的。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述高温是约90°C或者更高的温度。
20.根据权利要求15所述的方法，其中暴露于所述高温达约5分钟或者更长时间。
21.根据权利要求15所述的方法，其中暴露于所述高温达约60分钟或者更长时间。
22.—种控制由根据权利要求1-10中任一项所述的经修饰的木霉属宿主细胞表达的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是热敏感的或者热不稳定的，所述方法包括使所述热敏感性或者热不稳定性目的多肽和所述内源多肽经历高温， 其中所述高温足以灭活所述内源多肽和所述热敏感性或者热不稳定性多肽。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述内源多肽是纤维素酶。
24.根据权利要求22所述的方法，还包括在使所述热敏感性或者热不稳定性目的多肽经历所述高温之前，使所述目的多肽与所述目的多肽能够对其起作用的化合物接触。
25.根据权利要求23所述的方法，还包括在使所述热敏感性或者热不稳定性目的多肽经历所述高温之前，使所述目的多肽与所述纤维素酶和所述目的多肽能够对其起作用的一种或者多种化合物接触。
26.一种从丝状真菌宿主细胞获得或者可从丝状真菌宿主细胞获得并包含疏水蛋白II的发酵液组合物，所述发酵液基本上不含纤维素酶和/或甘露聚糖酶活性，且其中所述疏水蛋白II在根据权利要求11或者12中任一项所述的经修饰的木霉属宿主细胞中产生。
27.一种从根据权利要求1-10中任一项所述的经修饰的木霉属获得或者可从所述经修饰的木霉属获得的发酵液。
28.一种控制权利要求27所述的发酵液中的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是热敏感的或者热不稳定的，所述方法包括使所述发酵液经历足以灭活所述内源多肽和所述热敏感性或者热不稳定性多肽的高温。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述内源多肽是纤维素酶。
30.根据权利要求28所述的方法，还包括在使所述发酵液经历所述高温之前，使所述发酵液与所述目的多肽能够对其起作用的目的化合物接触。
31.根据权利要求29所述的方法，还包括在使所述发酵液经历所述高温之前，使所述发酵液与所述纤维素酶和所述目的多肽能够对其起作用的一种或者多种化合物接触。
32.—种控制从权利要求1-10中任一项所述的经修饰的木霉属宿主细胞获得的组合物中存在的纤维素酶的活性的方法，其中所述组合物包含至少一种EGV之外的纤维素酶，所述方法包括使所述组合物经历足以灭活所述目的多肽的高温，并且其中在使所述组合物经历高温之后所述组合物基本上不含纤维素酶活性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是热敏感的或者热不稳定的。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是耐热的或者热稳定的。
35.根据权利要求32所述的方法，其中使所述组合物经历高温是在食品或者饮料中进行。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述高温是小于约100°C。
37.根据权利要求32所述的方法，其中从所述经修饰的木霉属宿主细胞获得的组合物是包含疏水蛋白的发酵液。
【文档编号】C12N1/15GK103562402SQ201180050749
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2011年10月19日 优先权日:2010年10月20日
【发明者】A·米亚斯尼科夫, M·舍尔, M·华德 申请人:丹尼斯科美国公司