专利名称：友菌素的生物合成基因簇及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素友菌素(amicetin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
背景技术：
友菌素是一类二糖核苷类抗生素，其结构式如图1所示，其能有效抑制革兰氏阳性和阴性细菌、结核杆菌，对鸡球虫病和肺结核病有一定的疗效，并有抗病毒功能(如 1 型疱疹病毒 herpesvirus 和脊髓灰质炎病毒 poliovirus 等)[Med. Res. Rev. (1984)4 471-512]。友菌素主要由Str印tomyces和AethrcAater产生，其主要结构特点是以胞嘧啶为基本骨架，通过一位氮连接两个脱氧己糖amicetose和amosamine，通过四位氮耦合了一个分子的对氨基苯甲酸和一个分子的α-甲基丝氨酸。友菌素的主要抗菌作用机制是通过结合到宿主23S核糖体RNA的一个非常保守的“肽酰转移酶中心”区域，从而阻断宿主的蛋白质合成[Embo J. (1994) 13:1682-1686]。采用同样机制的抗生素还包括氯霉素，大环内酯类抗生素和其他核苷类抗生素，如灭瘟素(blasticidin S)，谷氏菌素(gougerotin)， 抗螺霉素(anthelmycin)以及嘌呤霉素(puromycin)等[Med. Res. Rev. (1984)4 :471-512 ； Russ. Chem. Rev. (2004)73 :401-414]，其中友菌素对古细菌，细菌和真核生物的蛋白质合成都有抑制作用，被称为“通用”抗生素[EmboJ. (1994) 13:1682-1686]。
核苷类抗生素由于独特的活性而得到了人们的关注，尤其近二十年来生物技术的发展为了解核苷类抗生素的生物合成机制提供了新的平台和机遇[中国抗生素杂志.0009)34:1^-141]，越来越多的核苷类抗生素的生物合成基因簇被克隆和鉴定， 包括尼克霉素(nikkomycin) [Mol. Gen. Genet. (1999)262 :102-114 ；Mol. Gen. Genet. (2001)264 :662-673 ；Mol. Microbiol. (2005)55 1855-1866],多氧霉素(polyoxin) [J. Biol. Chem. (2009)284 :10627-10638],嘌呤霉素(puromycin)[Embo J. (1992) 11 785-792 ；J. Biol. Chem. (1996)271 :1579-1590],杀稻癌菌素 S (blasticidin S) [Chembiochem. (2003) 4 :821-828], streptothricins[J.Bacteriol. (1997) 179 6929-6936], toyocamycin[Chem. Biol. (2008) 15 :790-798], A-500359s[J.Antibiot.(2009)62 :325-332]， caprazamycin[J. Biol. Chem. (2009) 284 :14987-14996]， lipisidomycin[Chembiochem. (2010) 11(2) :191-196]及其类似物 A-90289 [Chembiochem.(2010)11(2) :184-190],其中国内的科学家系统研究了尼克霉素和多氧霉素的生物合成， 同时国内科学家也克隆和鉴定了米多霉素的两个生物合成酶[Chembiochem. (2008)9 1286-U94]。核苷类抗生素友菌素具有独特的二糖链，尤其是amosamine以独特的保留型糖苷键与amicetose相连，这种保留型的糖苷键在微生物天然产物中并不多见。因此，克隆和鉴定友菌素的生物合成基因簇，对于了解二糖链的形成机制，以及末端氨基酸 (α-methylserine)的合成及其构效关系，都显得非常必要。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种友菌素的生物合成基因簇。
本发明的友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，该友菌素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由其中的从7917位到34889位的碱基序列组成。
本发明的友菌素的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第7917位到 34889位的碱基序列所示，包含21个基因，其中8个脱氧糖合成酶基因(amiB，amiC, amiD, amiE,amiH,amiK,amiN,amiU)和2个糖基转移酶基因(amiJ，amiG)编码的蛋白负责友菌素两个脱氧糖基的生物合成，3个基因(amiA，amiM，amiL)编码的蛋白负责对氨基苯甲酸的生物合成，1个基因(amil)编码的蛋白负责胞嘧啶的生物合成，1个基因(amiF)编码的蛋白负责胞嘧啶脱氧核苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应，3个基因(amiT，amiR, amiS) 编码的蛋白负责末端氨基酸的生物合成，此外，还包括1个调控基因(amiP)，2个转运基因 (amiO, amiQ),具体为
1)脱氧糖合成基因，即 amiB，amiC, amiD, amiE, amiH, amiK, amiN, amiU 共 8 个基因
amiB位于基因簇核苷酸序列第9160-10278个碱基处，长度为1119个碱基对，编码氨基转移酶，372个氨基酸；
amiC位于基因簇核苷酸序列第10275-11651个碱基处，长度为1377个碱基对，编码NDP-己糖-2，3-脱水酶，458个氨基酸；
amiD位于基因簇核苷酸序列第11648-U616个碱基处，长度为969个碱基对，编码 NDP-己糖-3-酮还原酶，322个氨基酸；
amiE位于基因簇核苷酸序列第12778-13551个碱基处，长度为774个碱基对，编码葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶，257个氨基酸；
amiH位于基因簇核苷酸序列第16530-17279个碱基处，长度为750个碱基对，编码甲基转移酶，249个氨基酸；
amiK位于基因簇核苷酸序列第19048-19995个碱基处，长度为948个碱基对，编码 NDP-己糖-4-酮还原酶，315个氨基酸；
amiN位于基因簇核苷酸序列第23609-249 个碱基处，长度为1320个碱基对，编码⑶P-4-酮-6-脱氧葡萄糖-3-脱水酶，439个氨基酸；
amiU位于基因簇核苷酸序列第33825-34889个碱基处，长度为1065个碱基对，编码dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶，354个氨基酸；
2)糖基转移酶基因，即amiJ，amiG共两个基因
ami J位于基因簇核苷酸序列第17821-19032个碱基处，长度为1212个碱基对，编码胞嘧啶葡萄糖酸合成酶/糖基转移酶，403个氨基酸；
amiG位于基因簇核苷酸序列第15035-16522个碱基处，长度为1488个碱基对，编码糖基转移酶，495个氨基酸；
3)对氨基苯甲酸合成基因，即amiA，amiM, amiL共三个基因
amiA位于基因簇核苷酸序列第7917-8711个碱基处，长度为795个碱基对，编码 4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶，264个氨基酸；
amiL位于基因簇核苷酸序列第20038-21534个碱基处，长度为1497个碱基对，编码苯辅酶A合成酶，498个氨基酸；
amiM位于基因簇核苷酸序列第21531-23564个碱基处，长度为2034个碱基对，编码对氨基苯甲酸合成酶，677个氨基酸；
4)胞嘧啶生物合成基因，即amil共1个基因
amil位于基因簇核苷酸序列第17276-178 个碱基处，长度为549个碱基对，编码 (脱氧)胞苷脱氧核糖转移酶，182个氨基酸；
5)酰基转移酶基因，即amiF共1个基因；
amiF位于基因簇核苷酸序列第13592-14998个碱基处，长度为1407个碱基对，编码酰基转移酶，468个氨基酸；
6)末端丝氨酸生物合成基因，即amiR，amiS, amiT共3个基因
amiR位于基因簇核苷酸序列第观935_四834个碱基处，长度为900个碱基对，编码丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶，299个氨基酸；
amiS位于基因簇核苷酸序列第29925-31283个碱基处，长度为1359个碱基对，编码丝氨酸羟甲基转移酶，452个氨基酸；
amiT位于基因簇核苷酸序列第313四_33794个碱基处，长度为M66个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，821个氨基酸；
7)调控基因，即amiP共1个基因
amiP位于基因簇核苷酸序列第沈996_27634个碱基处，长度为639个碱基对，编码 TetR家族的转录调节子，212个氨基酸；
8)转运基因，即amiO，amiQ共2个基因
amiO位于基因簇核苷酸序列第24970-26649个碱基处，长度为1680个碱基对，编码ABC家族转运蛋白，559个氨基酸；
amiQ位于基因簇核苷酸序列第2768448877个碱基处，长度为1194个碱基对，编码主要易化超家族转运蛋白，397个氨基酸。
SEQ ID NO. 1所示序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分 SEQ IDN0. 1所示序列中DNA序列的重组DNA载体的途径。
本发明还提供了产生友菌素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列SEQ ID NO. 1的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与友菌素生物合成基因相似的基因。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从 Streptomyces vinaceus-drappus NRRL 2363基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有S. vinaceus-drappus NRRL 2363基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNAshuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成脱氧糖amosamine、 amicetose、褶皱菌素及正褶皱菌素，进一步催化合成抗生素友菌素。
因此本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备友菌素及其类似物中的应用。
本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amosamine中的应用。
本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amicetose中的应用。
本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备褶皱菌素及其类似物中的应用。
本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备正褶皱菌素及其类似物中的应用。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断友菌素生物合成的一个或几个步骤而得到新的友菌素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高友菌素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。
本发明所提供的友菌素的糖基转移酶、甲基转移酶或其他酶提供了通过遗传修饰得到类似物的途径。
总之，本发明所提供的包含友菌素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解友菌素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
用于本发明的酒红土褐链霉菌NRRL2363 (Sti^ptomyces vinaceusdrappus NRRL 2363)，保藏于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，简写NRRL)，其登录号为 NRRL 2363。
图1是友菌素的化学结构；
图2(A)是友菌素生物合成基因簇的结构示意图和限制性内切酶谱。B代表限制性内切酶BamHI，E代表限制性内切酶EcoRI，X*代表原始载体pOJ446中的限制性内切酶父匕&1，5*代表原始载体？0446中的限制性内切酶& 1。(B)pCSG3104的亚克隆。pCSG3201 11650bp BamHI/NdeI 片段克隆至 pED8a ；pCSG3202 :8479bp NotI 片段克隆至 pUCPU21 ； PCSG3203 :8479bp BamHI/Spel 片段克隆至 pED8a ；pCSG3205 :10903bp NotI 片段克隆至 PUCPU21 ；pCSG3206 :9008bp Xbal/Hindlll 片段克隆至pUCPU21 ；pCSG3207 :5953bp NotI 片段克隆至PUCPU21。
图3是友菌素生物合成基因簇的异源表达和基因簇边界的确定。(A)友菌素生物合成基因簇在S. Iivdans TK64中异源表达代谢产物的高压液相分析，(I)包含载体pOJ446 的TK64，(II)包含质粒pCSG3104(含完整的友菌素生物合成基因簇)的TK64，(III)友菌素标准品，(IV)化合物正褶皱菌素(9)和褶皱菌素(10)的标准品。(B)友菌素野生型生产菌酒红土褐链霉菌NRRL2363(V)，Aorf(-l)突变株AMlOOl (VI)和Aorfl突变株 AMlOll (VII)的代谢产物的高压液相分析；
图4是提出的友菌素两个脱氧糖amosamine和amicetose的生物合成途径；
图5是提出的友菌素的生物合成途径；
图6是友菌素生物合成基因突变株代谢产物的高压液相分析及所产化合物的结构式。㈧友菌素生物合成基因突变株代谢产物的高压液相分析，(I)AamiB突变株 AM1002，(II) AamiF 突变株 AM1003，(III) Δ amiG 突变株 AM1004，(IV) AamiH 突变株 AM1005，(V) AamiI 突变株 AMlOO6，(VI) Δ amiL 突变株 AMIOO7，(VII) AamiP 突变株 AM1008, (VIII) AamiR 突变株 AM1009，(IX) Δ amiS 突变株 AM1010，(X) AamiT 突变株 AM1012, (XI)友菌素野生型生产菌酒红土褐链霉菌NRRL2363。(B)突变株所产化合物2_11 的化学结构式；图7是对氨基苯甲酸(PABA)在突变株AM1006中生物转化为4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)。(A)对氨基苯甲酸生物转化的示意图。(B)生物转化菌株的高压液相分析，(I)突变株AM1006，(II)突变株AM1006添加ImM的对氨基苯甲酸，(III)突变株AM1006添加IOmM的对氨基苯甲酸，(IV)对氨基苯甲酸标准品，(V) 4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸⑶标准品；
图8是糖基转移酶AmiG的异源表达和分离纯化的蛋白电泳分析。(A)糖基转移酶AmiG在大肠杆菌中的异源表达。1，E. coli BL21 (DE3)/pET28a全细胞提取物；2，Ε. coli BL21 (DE3)/pCSG3247全细胞提取物；3，E. coli BL21 (DE3)/pCSG3247全细胞提取物的上清部分；M，蛋白标准分子量。⑶糖基转移酶AmiG的分离纯化。1，纯化后的4!^6(化1);1， 纯化后的AmiG (5 μ 1)；
图9是AmiG催化的代表性反应。㈧在TDP或UDP介导下AmiG催化的逆向反应， 如AmiG可催化由化合物正褶皱菌素(9)变成化合物12，同时生成核苷糖。(B)AmiG催化的正向反应，如在TDP-葡萄糖(TDP-glucose)或UDP-葡萄糖(UDP-glucose)存在时，AmiG 可催化化合物4的加糖反应形成化合物13。(C)AmiG催化的交换反应，如在AmiG的反应体系中同时加入化合物4和化合物10，AmiG可先进行逆向催化将化合物10转化为化合物12 和TDP-amosamine，再将形成的TDP-amosamine经正向反应添加到化合物4上，最终形成化合物1 ；
图10是AmiG催化反应的高压液相分析。㈧AmiG催化的逆向反应，i)对照反应， 100 μ M 化合物 9，ImM TDP，无 AmiG ;ii) 100 μ M 化合物 9，ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ;iii) 100 μ M 化合物9，ImM UDP,5yM AmiG ;iv) 100 μ M化合物 10，ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ;ν) 100 μ M化合物 7, ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ；vi) 100 μ M 化合物 1, ImM TDP, 5 μ MAmiG ；vii) 100 μ M 化合物 6，ImMTDP,5yM AmiG0 (B)AmiG催化的正向反应和交换反应，viii)对照反应，100 μ M化合物4， ImM TDP-glucose, ^AmiG ；ix) 100 μImM TDP-glucose, 5 μ M AmiG ；χ) 100 μ M^合物4，ImM 皿卩飞111(；086，无六1^6;11)10(^]\1化合物4，11111 UDP-glucose, 5 μ M AmiG ；xii) 对照反应，50 μ M化合物4，100 μ M化合物10，无AmiG ；xiii) 50 μ M化合物4，100 μ M化合物 10，5μΜ AmiGo
具体实施例方式
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
1、友菌素生物合成基因簇克隆、序列分析及功能分析
友菌素(图1)结构中含有一分子的对氨基苯甲酸(PABA，para-Amino Benzoic Acid)，通过比较一些次级代谢产物的PABA合成酶AurG (aureothin， Streptomyces thioluteus, CAE02603)，PabAB (Streptomyces sp.FR-008, AAQ82560)， PabAB(chloramphenicol, Streptomyces venezuelaeISP5230, AAB30312)的氨基酸序列， 确定了保守区域，设计兼并性引物 PABA-2F :5' -GGGVGT SCA GTT CCM MCC SGA GTC-3‘ 和 PABA-5R:5' -CAG GTC GAC GAT CAT SAG GTTCTC GGC-3 ‘，成功从酒红土褐链霉菌 (Streptomyces vinaceus-drappus) NRRL 2363 基因组中扩增到一个 1. Ikb 的 DNA 片段，经克隆到T载体并测序确认了该片段与上述PABA合成酶有一定的相似性，从而暗示克隆到的基因片段很有可能参与了友菌素中对氨基苯甲酸结构域的生物合成。以该DNA片段为筛选探针，从酒红土褐链霉菌NRRL 2363基因组文库约2000个克隆中，成功筛选到9个阳性柯斯质粒，其中阳性克隆PCSG3104在异源宿主变铅青链霉菌(Sti^ptomyces lividans) TK64 中表达可使其产生友菌素及其中间体，表明PCSG3104包含了友菌素生物合成所必须的全部基因。对PCSG3104进行DNA测序分析表明其插入序列全长为37337bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，GC含量为68. 5%，生物信息学分析包含了沈个开放阅读框(表1，图2)，其中 21个开放阅读框(amiA-amiU)可能与友菌素的生物合成有关。根据基因编码蛋白的功能分析，两个转座基因amiO和amiQ可能与友菌素的转运输送相关；一个调控子基因amiP可能与友菌素生物合成的调控相关；八个基因(amiB-amiE，amiH, amiK, amiN和amiU)可能和友菌素中的两个脱氧糖的生物合成相关；两个糖基转移酶基因amiG和amij可能和两个脱氧糖的添加有关；核苷2-脱氧戊糖转移酶基因amil可能参与胞嘧啶的合成；四个基因 (amiM，amiA, amiL和amiF)可能参与对氨基苯甲酸的生物合成；三个基因(amiS，amiT和 amiR)可能参与末端α -甲基丝氨酸的生物合成。
表1 友菌素生物合成基因簇的基因及其功能分析
权利要求
1.一种友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 7917位到34889位的碱基序列所示。
2.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备友菌素及其类似物中的应用。
3.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amosamine中的应用。
4.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amicetose中的应用。
5.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备褶皱菌素及其类似物中的应用。
6.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备正褶皱菌素及其类似物中的应
全文摘要
本发明公开一种友菌素的生物合成基因簇及其应用。包含21个基因，其中8个脱氧糖合成酶基因(amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU)和2个糖基转移酶基因(amiJ，amiG)编码的蛋白负责友菌素两个脱氧糖基的生物合成，3个基因(amiA，amiM，amiL)编码的蛋白负责对氨基苯甲酸的生物合成，1个基因(amiI)编码的蛋白负责胞嘧啶的生物合成，1个基因(amiF)编码的蛋白负责胞嘧啶脱氧核苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应，3个基因(amiT，amiR，amiS)编码的蛋白负责末端氨基酸的生物合成，此外，还包括1个调控基因(amiP)，2个转运基因(amiO，amiQ)。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
文档编号C12N15/53GK102533813SQ20121003083
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者张光涛, 张改云, 张海波, 张长生, 朱义广, 李苏梅, 肖吉, 陈瑞东, 鞠建华 申请人:中国科学院南海海洋研究所