专利名称：以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳酸菌表达质粒的构建，特别是一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，属于生物技术领域。
背景技术：
目前乳酸菌表达载体应用较多的是质粒pMG36e，为组成型表达载体，由强启动子 P32及其下游的部分开放阅读框、多克隆位点和来自乳酸乳菌乳脂亚种蛋白酶基因(prtP) 的转录终止子、以及pWVOl复制子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因Emr构成,质粒大小为3.6kb。该质粒便于宿主携带，可组成型表达外源目的基因。目前已在乳球菌属 (Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)等中成功表达多种外源基因。但由于该质粒以红霉素抗性基因作为筛选标志，在人体中不能以抗生素作为选择压力。在没有了选择压力的情况下，质粒载体易丢失，从而不能实现外源抗原基因的长期稳定表达，限制了它在食品及医药工业方面的实际应用。因此，研发以食品级选择标记取代抗生素抗性标记载体，构建对人体和环境安全的食品级活载体成为疫苗、食品、药品应用研究方面的热点。乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌产生的一种低聚肽，能够抑制大多数革兰氏阳性和阴性细菌的生长。目前已对Nisin的安全性问题进行了系统的研究。人类大肠中存在产Nisin的益生菌乳酸链球菌菌株，天然牛奶及乳酪和酸奶中也存在Nisin的乳酸链球菌菌株。Nisin广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中，它随着食品被人们摄入，不改变肠道正常菌群，没发现毒性问题，是一种安全的天然产物。FA0/WH0食品添加剂联合专家委员会、美国FDA、我国卫生部等50多个国家及地区已批准Nisin应用于食品。因此利用Nisin 为诱导物的表达调控系统，构建以Nisin为选择标记的乳酸菌食品级质粒载体，依靠人类大肠中天然存在产Nisin的益生菌乳酸链球菌产生的Nisin作为选择压力，可以实现长期稳定表达目的抗原蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，是用来自乳酸菌载体PNZ9530的Nisin元件替换乳酸菌质粒pMG36e红霉素抗性基因作为选择标记，通过PCR扩增、基因克隆、合成多克隆位点 MCS、加入嗜酸乳杆菌信号肽Ins、消除抗性基因Emr来实现Nisin食品级表达/分泌型载体 PMN-5的构建。本发明的一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建方法包括以下步骤
(1)以pNZ9530为模板PCR扩增Nisin元件，在其2端插入酶切位点SphI与SacI；
(2)将上述步骤扩增得到的Nisin元件插入骨架载体pMG36e；(3)PCR扩增启动子元件Pins，于其2端加入酶切位点EaRI，并于Pins片段中插入Hpa I酶切位点；
(4)将步骤(3)获得的Pinsl片段插入骨架载体PMN-I中，得到载体PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位点MCS，并插入载体PMN-2中，得到载体PMN-3；
(6)合成嗜酸乳杆菌信号肽Ins，并将其插入步骤(5)获得载体PMN-3至多克隆位点MCS 后，得到载体PMN-4 ；
(7)利用步骤(3)添加的HpaI酶切位点消除载体PMN-4的抗性基因Emr，获得食品级表达/分泌载体PMN-5，完成以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建。所述Nisin元件来自于人类大肠中天然存在产Nisin的益生菌乳酸链球菌。本发明相对于现有技术的有益效果是
(1)本发明的以食品级选择标记取代了抗生素抗性标记载体，所构建出来的食品级表达/分泌载体PMN-5为食品级活载体，对人体和环境安全系数高，可广泛应用于疫苗、食品、 药品的应用研究；
(2)本发明是依靠人类大肠中天然存在产Nisin的益生菌乳酸链球菌所产生的Nisin 作为选择压力，质粒载体不易丢失，可实现外源抗原基因的长期稳定表达，实现长期稳定表达目的抗原蛋白；
(3)本发明的构建方法相较于过去繁琐耗时的构建方法，简化了乳酸菌表达质粒的构建方法，且该方法的可操作性强。
图I为本发明所述以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建技术路线图。图2为实施例2中基于Nisin系统的食品级重组幽门螺杆菌二价嗜酸乳杆菌活疫苗的研制路线图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例I 采用本发明方法，按下列步骤构建一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒
(1)以pNZ9530为模板PCR扩增Nisin元件，在其2端插入酶切位点SphI与SacI；
(2)将上述步骤扩增得到的Nisin元件插入骨架载体pMG36e；
(3)PCR扩增启动子元件Pinsl，于其2端加入酶切位点EaRI，并于Pins片段中插入 Hpa I酶切位点；
(4)将步骤(3)获得的Pinsl片段插入骨架载体PMN-I中，得到载体PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位点MCS，并插入载体PMN-2中，得到载体PMN-3；
(6)合成嗜酸乳杆菌信号肽Ins，并将其插入步骤(5)获得载体PMN-3至多克隆位点MCS 后，得到载体PMN-4 ；
(7)利用步骤(3)添加的HpaI酶切位点消除载体PMN-4的抗性基因Emr，获得食品级表达/分泌载体PMN-5，完成以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建。实施例2 结合本发明方法，按照下列步骤实现基于Nisin系统的食品级重组幽门螺杆菌二价嗜酸乳杆菌活疫苗的研制。I、食品级表达/分泌型载体PMN-5中的构建
(1)以pNZ9530为模板PCR扩增Nisin元件，在其2端插入酶切位点SphI与SacI；
(2)将上述步骤扩增得到的Nisin元件插入骨架载体pMG36e；
(3)PCR扩增启动子元件Pinsl，于其2端加入酶切位点EaRI，并于Pins片段中插入 Hpa I酶切位点；
(4)将步骤(3)获得的Pinsl片段插入骨架载体PMN-I中，得到载体PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位点MCS，并插入载体PMN-2中，得到载体PMN-3；
(6)合成嗜酸乳杆菌信号肽Ins，并将其插入步骤(5)获得载体PMN-3至多克隆位点MCS 后，得到载体PMN-4 ；
(7)利用步骤(3)添加的HpaI酶切位点消除载体PMN-4的抗性基因Emr，获得食品级表达/分泌载体PMN-5，完成以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建。2、基于Nisin系统的食品级重组幽门螺杆菌二价嗜酸乳杆菌活疫苗的研制
(1)通过PCR扩增分别获得幽门螺杆菌(Hp)黏附素hp0410和尿素酶UrbB基因(抗原表位区域)，T_A克隆,测序，中间添加柔性肽Gly* Gly* Gly* Gly*Ser*Ser*Ser*Ser*Ser片段链接，完成Hp黏附素hp0410和尿素酶UrbB基因的融合，加入信号肽，获得融合基因。将融合基因克隆入食品级表达/分泌型载体PMN-5中(如图2所示)，通过Nisin天然抗性筛选，进行表达量的分析与密码子偏好性的优化；
(2)将筛选出的PMN5-ureB-hp0410电转化至嗜酸乳杆菌ATCC4356，构建高效表达黏附素Hp0410和UreB的二价天然抗性食品级重组嗜酸乳杆菌ATCC4356 (PMN5_ureB_ hp0410)活载体疫苗；
(3 )采用桥联法ELISA测定食品级二价重组嗜酸乳杆菌ATCC4356 (PMN5_ureB_ hp0410)培养上清液和裂解上清液中UreB和黏附素hp0410的抗原性，参照Meacock叙述的方法及重组菌的生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性，通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性；
(4)建立Hp感染SPF级雌性C57BL/6小鼠模型，在该模型中评价重组二价Hp嗜酸乳杆菌预防Hp感染的效果，运用细菌培养法和病理组织法观察小鼠胃黏膜的完全保护率及定植量的改变，流式细胞术分析小鼠脾细胞亚型变化情况，IL2和IL4细胞依赖株的细胞测活法检测细胞因子，ELISA法检测小鼠血清及肠液中抗UreB和hp0410的抗体产生情况，探讨重组嗜酸乳杆菌ATCC4356 (PMN5-ureB- hp0410)可能的免疫防治机制。
权利要求
1.一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，其特征在于是用来自乳酸菌载体PNZ9530的Nisin元件替换乳酸菌质粒pMG36e红霉素抗性基因作为选择标记，通过PCR扩增、基因克隆、合成多克隆位点MCS、加入嗜酸乳杆菌信号肽Ins、消除抗性基因Emr来实现Nisin食品级表达/分泌型载体PMN-5的构建。
2.一种如权利要求I所述的以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，其特征在于其构建方法包括以下步骤Cl)以pNZ9530为模板PCR扩增Nisin元件，在其2端插入酶切位点SphI与SacI ；(2)将上述步骤扩增得到的Nisin元件插入骨架载体pMG36e；(3)PCR扩增启动子元件Pins，于其2端加入酶切位点EaRI，并于Pins片段中插入Hpa I酶切位点；(4)将步骤(3)获得的Pinsl片段插入骨架载体PMN-I中，得到载体PMN-2；(5)合成小片段多克隆位点MCS，并插入载体PMN-2中，得到载体PMN-3；(6)合成嗜酸乳杆菌信号肽Ins，并将其插入步骤(5)获得载体PMN-3至多克隆位点MCS 后，得到载体PMN-4 ；(7)利用步骤(3)添加的HpaI酶切位点消除载体PMN-4的抗性基因Emr，获得食品级表达/分泌载体PMN-5，完成以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建。
3.如权利要求I或2所述的以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，其特征在于所述Nisin元件来自于人类大肠中天然存在产Nisin的益生菌乳酸链球菌。
全文摘要
本发明涉及一种以Nisin作为天然抗性筛选标记的乳酸菌表达质粒的构建，属于生物技术领域。本发明的构建方法是用来自乳酸菌载体pNZ9530的Nisin元件替换乳酸菌质粒pMG36e红霉素抗性基因作为选择标记，通过PCR扩增、基因克隆、合成多克隆位点、加入嗜酸乳杆菌信号肽、消除抗性基因来实现Nisin食品级表达/分泌型载体的构建。本发明是以食品级选择标记取代了抗生素抗性标记载体，所构建的食品级表达/分泌载体为食品级活载体，对人体和环境安全系数高，可广泛应用于疫苗、食品、药品的应用研究，本发明构建方法可实现外源抗原基因的长期稳定表达，获得长期稳定表达目的抗原蛋白，且方法简单、可操作性强。
文档编号C12N15/64GK102586314SQ20121003351
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者白杨, 范宏英, 龙北国 申请人:白杨, 范宏英, 龙北国